王婷健， 王莎莉

(重慶醫(yī)科大學(xué)生理教研室, 重慶 400016)

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石墨烯量子點(diǎn)對(duì)大鼠造血系統(tǒng)的影響*

王婷健， 王莎莉△

(重慶醫(yī)科大學(xué)生理教研室, 重慶 400016)

目的：研究石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)對(duì)大鼠造血系統(tǒng)的影響。方法：30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組(n=10)：對(duì)照組、高、低劑量GQDs實(shí)驗(yàn)組(10 mg/kg·d，5 mg/kg·d)，對(duì)照組尾靜脈注射等容積生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射GQDs，連續(xù)28 d。麻醉處死,心臟取血，檢測(cè)血常規(guī)及肝腎功能，獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMCs),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況。另取3只健康雄性SD大鼠體外培養(yǎng)大鼠四肢骨髓單個(gè)核細(xì)胞，GQDs分別作用24 h，48 h，72 h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中粒-巨細(xì)胞刺激集落因子(GM-CSF)含量。結(jié)果：GQDs 在10 mg/kg·d劑量范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組大鼠紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白濃度顯著增高(P<0.05)；白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有增高的趨勢(shì)；骨髓單個(gè)核細(xì)胞周期DNA合成前期(G1期)縮短(P<0.01)，DNA合成期(S期)顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，細(xì)胞凋亡無明顯影響; 甘油三酯和高密度蛋白濃度顯著降低(P<0.01)。GQDs作用72 h大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞明顯增殖(P<0.05),細(xì)胞上清液中GM-CSF含量顯著增加(P<0.01)。結(jié)論：一定濃度的GQDs可促進(jìn)大鼠造血功能。

石墨烯量子點(diǎn)；造血系統(tǒng)；骨髓單個(gè)核細(xì)胞；大鼠

石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs)是由碳原子組成的石墨烯家族的最新成員,作為一種新型碳材料量子點(diǎn),其量子限制效應(yīng)和邊效應(yīng)可誘導(dǎo)自身發(fā)出熒光；利用含氧活性基團(tuán)化學(xué)反應(yīng)性不同, 可以與多種有特定化學(xué)和生物性能的化學(xué)基團(tuán)和功能分子進(jìn)行共價(jià)反應(yīng),對(duì)石墨烯進(jìn)行表面功能化修飾，達(dá)到超高的載藥量、靶向輸送和藥物的可控釋放的目的。由于其穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì),特殊熒光特性,良好生物安全性[1，2]和水溶液穩(wěn)定性,越來越受到人們的重視。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域作為藥物載體[3,4]、細(xì)胞組織成像[5,6]、DNA嵌入劑[7]、熒光探針[8]等已得到廣泛應(yīng)用, 但其對(duì)機(jī)體造血功能的影響還未見到相關(guān)報(bào)道。本研究將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究GQDs對(duì)大鼠造血系統(tǒng)的影響,為其應(yīng)用于改善及保護(hù)造血系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù).

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑:CCK-8試劑盒(Dojindo)，ELISA檢測(cè)試劑盒(ABCAM公司)，石墨烯量子點(diǎn)(購自南京先豐納米有限公司)，白蛋白測(cè)定試劑盒、球蛋白測(cè)定試劑盒，肌酐測(cè)定試劑盒、總膽固醇測(cè)定試劑盒、總蛋白測(cè)定試劑盒、甘油三酯測(cè)定試劑盒，高密度脂蛋白測(cè)定試劑盒,均購自北京利德曼生化股份有限公司。

儀器:流式細(xì)胞儀(Beckman，美國)；酶標(biāo)儀(普天-PT，國產(chǎn))；紫外/可見分光光度計(jì) (Lambda25, 美國) ；日本光電血細(xì)胞分析儀及配套試劑(MEK-6318K，日本)；全自動(dòng)生化分析儀(CS-T300，國產(chǎn))

1.2實(shí)驗(yàn)分組

健康雄性SD大鼠30只 (重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重180～200 g,隨機(jī)均分成 3組(n=10)：對(duì)照組、高劑量實(shí)驗(yàn)組、低劑量實(shí)驗(yàn)組,分3籠飼養(yǎng)。適應(yīng)7 d 后,每只實(shí)驗(yàn)大鼠稱重，高劑量實(shí)驗(yàn)組給藥劑量10 mg/kg·d,低劑量實(shí)驗(yàn)組給藥劑量5 mg/kg·d，尾靜脈注射GQDs水溶液，對(duì)照組注射等容積生理鹽水,連續(xù)注射5 d，間隔2 d，注射28 d，28 d 后取材。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1一般情況每天在規(guī)定時(shí)間內(nèi)記錄飲食和體重，并觀察飲食、排泄、皮毛、活動(dòng)狀況和反應(yīng)等。

1.3.2血常規(guī)及肝腎功能上述大鼠處理28 d后，腹腔注射致死劑量麻醉劑水合氯醛，心臟取血，收集血液樣品于凝血管中，醫(yī)院送檢。日本光電血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo):白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell,WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell,RBC)、血紅蛋白測(cè)定(hemoglobin，HB)、紅細(xì)胞比積(hematocrit，HCT)、紅細(xì)胞平均容量(mean corpuscular volume,MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin,MCHC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count,PLT)、淋巴細(xì)胞(LY)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)肌酐(creatinine,Cr)、總蛋白(totalprotein,TP)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、球蛋白(globulin,G)、白蛋白(albumin,A)、甘油三酯(triglycerides,TG)。

1.3.3GQDs對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡的影響實(shí)驗(yàn)大鼠心臟取血后，無菌條件下迅速取其股骨，在超凈臺(tái)中將全部骨髓沖入4℃ 5 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，反復(fù)吹打獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells,BMCs)懸液,隨后以4℃ 1 000×g 離心5 min,細(xì)胞團(tuán)用5 ml磷酸緩沖液重新懸浮，將骨髓細(xì)胞懸液緩慢置于2ml的淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g 離心20 min,離心后細(xì)胞分為3層,收取位于分離遞質(zhì)之間的單個(gè)核細(xì)胞,PBS重懸,再低溫離心2次×5 min，以洗除殘余淋巴細(xì)胞分離液，用無菌PBS 制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù), 1 000×g 離心5 min, 500 μl滅菌磷酸鹽緩沖液復(fù)懸,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期; 1 000×g 離心 5 min，-20℃，70%乙醇溶液中固定，4℃保存過夜,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4體外實(shí)驗(yàn)觀察GQDs對(duì)造血系統(tǒng)的影響

1.4.1CCK-8檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖另取健康雄性SD大鼠3只 (重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重 180～200 g,頸椎脫臼處死,無菌條件下迅速取其股骨，在超凈臺(tái)中將3只大鼠全部骨髓混合沖入4℃ 5 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中,反復(fù)吹打獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，隨后以4℃、1 000×g離心5 min,細(xì)胞團(tuán)用5 ml磷酸緩沖液重新懸浮,將骨髓細(xì)胞懸液緩慢置于2 ml的淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g離心20 min,離心后細(xì)胞分為3層,收取位于分離遞質(zhì)之間的單個(gè)核細(xì)胞,PBS溶液重懸,再低溫離心2次×5 min,以洗除殘余淋巴細(xì)胞分離液,用滅菌PBS 制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),按1×104cells/ml的細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)置正常對(duì)照組、高濃度實(shí)驗(yàn)組(500 μg/ml)、低濃度實(shí)驗(yàn)組(250 μg/ml),每組5個(gè)復(fù)空置37℃、5%CO2、95%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h,48 h,72 h,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl CCK-8試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.4.2ELISA檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞上清液GM-CSF含量另取健康雄性SD大鼠1只 (重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重 180～200 g,頸椎脫臼處死,無菌條件下迅速取其股骨，在超凈臺(tái)中將大鼠全部骨髓沖入4℃ 5 ml滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中,反復(fù)吹打獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，隨后以4℃、1 000×g離心5 min,細(xì)胞團(tuán)用5 ml磷酸緩沖液重新懸浮,將骨髓細(xì)胞懸液緩慢置于2 ml的淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077 g/ml)之上,在4℃、2 000×g離心20 min,離心后細(xì)胞分為3層,收取位于分離遞質(zhì)之間的單個(gè)核細(xì)胞,PBS溶液重懸,再低溫離心2次×5 min,以洗除殘余淋巴細(xì)胞分離液,用無PBS 制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),按1×106cells/ml的細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)置正常對(duì)照組，GQDs高濃度(500 μg/ml)實(shí)驗(yàn)組，GQDs低濃度(250 μg/ml)實(shí)驗(yàn)組,分別培養(yǎng)48 h，72 h后，細(xì)胞液2 000×g離心20 min,收集細(xì)胞上清液, 利用 ELISA 法測(cè)定細(xì)胞上清液中粒-巨細(xì)胞刺激集落因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF)含量.操作步驟均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1一般情況觀察

高、低劑量實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物與生理鹽水對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠均皮毛光滑,反應(yīng)靈敏,飲食，活動(dòng)正常，體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。GQDs實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水尾靜脈注射期間，各組大鼠體重呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2GQDs對(duì)大鼠血常規(guī)

高、低劑量的GQDs實(shí)驗(yàn)組血常規(guī)檢測(cè)中紅細(xì)胞數(shù),血紅蛋白濃度有明顯增高,與生理鹽水對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,表2)。白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞有增高的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3GQDs對(duì)肝腎功能的影響

高、低劑量的GQDs組甘油三酯及高密度蛋白濃度與生理鹽水對(duì)照組相比均有明顯降低(P<0.05,P<0.01,表3)。

2.4GQDs對(duì)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞凋亡相比無顯著差異,GQDs對(duì)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡幾乎無影響(表4，圖1，見彩圖頁Ⅲ)。與對(duì)照組相比，高劑量組細(xì)胞周期DNA合成前期明顯縮短, DNA合成期明顯變長(zhǎng)(P<0.05,P<0.01，表4, 圖2，見彩圖頁Ⅲ)。

Tab. 1　Comparison of rats body weight after twenty eight days (g， ±s， n=10)

LD：Low dosage; HD: High dosage

Tab.

WBC: White blood cell； LY: Lymphocyte; RBC: Red blood cell； HG: Hemoglobin； MCHC: Mean corpuscular hemoglobin； MCV: Mean corpuscular volume; HCT: Hematocrit； PLT: Platelet; LD：Low dosage; HD: High dosage

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group; GODs: Graphen quantum dots

Tab. 3　Effectof GQDs on liver and kidney function on ±s， n=10)

CRE: Creatinine; TG: Triglyceride; CHO: Total cholesterol; HDL: Highdensity lipoprotein; G: Globulin; A: Albumin; TP: Total protein; LD: Low dosage; HD: High dosage

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab.

AR: Apoptosis ratio; LD: Low dosage; HD: High dosage; GQDs: Graphene quantum dots; BMCs: Bone marrow mononuclear cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.5GQDs對(duì)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外增殖的影響

GQDs作用48 h,72 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比OD值明顯上升(P<0.05，表5)。72 h后高濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率高達(dá)80%以上。

2.6GQDs作用大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞上清液中GM-CSF的含量變化

GQDs作用48 h, 72 h后高、低濃度實(shí)驗(yàn)組GM-CSF含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.01,表6)。

Group24h48h72hControl0.32±0.020.31±0.020.36±0.03LC0.37±0.03*0.39±0.01*0.61±0.04*HC0.38±0.03*0.43±0.02*0.70±0.06*

LC: Low concentration; HC: High concentration; GQDs: Graphene quantum dots； BMCs: Bone marrow mononuclear cells

*P<0.05vscontrol group

Group48h72h Control442.49±5.03469.76±12.11LC1166.15±6.65**1815.80±10.06**HC3196.89±15.74**3994.58±26.83**

LC: Low concentration; HC: High concentration; GQDs: Graphene quantum dots; GM-CSF: Granulocyte macrophage colony stimulating factor； BMCs: Bone marrow mononuclear cells

**P<0.01vscontrol group

3　討論

造血系統(tǒng)維持造血細(xì)胞的生成、調(diào)控、破壞,是維持機(jī)體生命活動(dòng)的基本保障。造血系統(tǒng)損傷導(dǎo)致的血液疾病成為危害人類健康的重要?dú)⑹种弧１Ｗo(hù)并改善人體造血系統(tǒng),不僅有助于治療各種血液疾病,還能輔助抗腫瘤。目前對(duì)惡性腫瘤的治療常采用化療和放療，但其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)常引起骨髓抑制，出現(xiàn)白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板減少等副反應(yīng),使得腫瘤治療達(dá)不到理想的治療效果。血細(xì)胞發(fā)生是造血干細(xì)胞經(jīng)增殖、分化直至成為各種成熟血細(xì)胞的過程。在這個(gè)過程中，造血細(xì)胞增殖活躍的特點(diǎn)是許多藥物以及生物材料使用過程中容易造成骨髓抑制的原因之一，從而限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。CdTe量子點(diǎn)等[9]納米材料對(duì)造血系統(tǒng)的影響表明，不同納米材料對(duì)造血系統(tǒng)影響不同。石墨烯量子點(diǎn)作為一種新型生物納米材料,已展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景，其對(duì)造血系統(tǒng)影響的研究以及應(yīng)用還比較缺乏。

我們首先給實(shí)驗(yàn)大鼠尾靜脈注射5 mg 和10 mg/kg·d GQDs溶劑 28 d，觀察GQDs對(duì)大鼠造血系統(tǒng)的影響。血常規(guī)檢測(cè)證實(shí)GQDs能明顯增高外周血中紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度，對(duì)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有增高的趨勢(shì)，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的凋亡沒有明顯影響，同時(shí)10 mg/kg·d GQDs可以使大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞G1期顯著降低，S期百分比明顯增高。S期是DNA合成期，是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)期，期間DNA含量將增加一倍，并合成一定數(shù)量的組蛋白，供DNA形成染色體初級(jí)結(jié)構(gòu)，因此S期細(xì)胞百分比的增加提示：GQDs能促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞周期活躍，造血功能增強(qiáng)，這與外周血中血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果基本一致,并且對(duì)肝腎功能不產(chǎn)生影響。

骨髓單個(gè)核細(xì)胞屬于造血干細(xì)胞進(jìn)一步分化增生的一系，其中含有少量的造血干、造血祖細(xì)胞以及紅系、粒系、單核系、巨核系、淋巴系。骨髓單個(gè)核細(xì)胞不僅是造血系統(tǒng)中重要的組成成員[10],還可分泌多種造血生長(zhǎng)因子, 具有重要的造血活性[11]。在骨髓單個(gè)核細(xì)胞分泌眾多的造血生長(zhǎng)因子中，GM-CSF是最重要的一種。GM-CSF為造血的正調(diào)控因子[12]，作用的主要靶細(xì)胞是骨髓不同發(fā)育階段的造血細(xì)胞，能在造血干、祖細(xì)胞水平上有效地刺激粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系增殖分化和成熟，還能與EPO協(xié)同促進(jìn)爆式紅系集落形成單位(BFU-E)形成，使G0期的造血祖細(xì)胞進(jìn)入S期，并縮短造血祖細(xì)胞的增殖時(shí)間。GM-CSF與白介素-3構(gòu)成的融合蛋白能促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖[13]。GQDs可明顯促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的增殖,同時(shí)具有時(shí)間和劑量依賴性。因此我們推測(cè)，GQD是通過促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞分泌GM-CSF，進(jìn)而作用于不同階段的造血細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞周期活躍，特別使G0期細(xì)胞進(jìn)入S期，最終上調(diào)造血功能，增加外周血紅細(xì)胞數(shù)量。但其對(duì)造血系統(tǒng)作用詳細(xì)機(jī)制研究有待進(jìn)一步深入。

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The effects of graphene quantum dots on hematopoietic system in rats

WANG Ting-jian, WANG Sha-li△

(Department of Physiology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective: To study the effects of graphene quantum dots(GQDs)on hematopoietic system in rats. Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into three groups (n=10):control group, high dose group(10 mg/kg·d), low dose group(5 mg/kg·d), The rats in experimental group were intravenous injected with GQDs for 28 days and those in control group were injected with normal saline at the same volume. Routine blood and the function of liver and kidney were detected by instrument analysis. The cycle and apoptosis of bone marrow mononuclear cells(BMCs) were detected by FCM. The other three only healthy male SD rat bone marrow mononuclear cells(BMCs) were cultured by joining GQDs for 24 h,48 h,72 h in vitro, the proliferation was assayed by CCK-8, the content of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) from cultural supernatants were detected by ELISA. Results: The amount of red blood cell and concentration of hemoglobin from experimental group were increased significantly compared with those of control groups(P<0.05), the concentration of triglyceride and high density lipoprotein were decreased. DNA synthesis period was prolonged(P<0.01), there was no significant difference in apoptosis. BMCs were promoted proliferation clearly after using GQDs for 72 h(P<0.05). The content of GM-CSF was increased(P<0.01). Conclusion: GQDs may promote hematopoietic function in rats.

graphene quantum dots;hematopoietic system;bone marrow mononuclear cells;rats

2015-06-08

2015-10-26

△Tel：023-68892728; E-mail: 63557408@qq.com

Q599

A

1000-6834(2016)01-060-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.016