袁紅英，王中師，王永清

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天麻素對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷的保護作用

袁紅英，王中師，王永清*

天麻素；中樞神經(jīng)元；缺氧

天麻為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的干燥塊莖，為常用名貴中藥，具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)之功效［1］，主要有效單體為天麻素（gastrodin，Gas），化學(xué)名稱為4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，又叫天麻苷，因其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、降壓、抗炎、抗氧化等作用，臨床上主要用于治療眩暈、頭痛、缺血性腦損傷等。為探討天麻素對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用機制，實驗考察了天麻素對培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷的作用［2-5］。

1　材料與方法

1.1實驗材料當(dāng)天新生Wistar大鼠，CO2培養(yǎng)箱（Baxer，美國），解剖顯微鏡（CarlZeiss，德國），塑料培養(yǎng)皿和96孔板（Nunc，丹麥），酶標(biāo)儀（山東高密儀器廠）；DMEM（高糖型，Sigma），HEPES（Sigma），EGTA（Sigma），馬血清（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），Hank’s平衡鹽溶液（Sigma），胰蛋白酶（新疆生化研究所），臺盼藍（華美生物工程公司），連二亞硫酸鈉（Sigma），CCK-8試劑盒（上海博谷生物科技公司）等。

1.2實驗方法

1.2．1大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的分散和培養(yǎng)取當(dāng)天新生的Wistar大鼠，用75%乙醇麻醉并消毒。取腦，剝離部分皮層，剪成1～2 mm的組織塊，用含0.25%胰蛋白酶的解剖液在37℃下消化30 min，然后將消化好的組織塊移入種植液中終止消化，在種植液中用滴管吹打細胞，使之均勻分散，制成細胞懸液（其間，取少量懸液以臺盼藍染液記數(shù)細胞）。將細胞按1×105/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中，置于36℃10%的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，12 h后更換含DMEM和胎牛血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到96板中。

1.2．2誘發(fā)缺氧損傷培養(yǎng)后的皮質(zhì)神經(jīng)元懸液，按每孔0.2 ml接種于96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，神經(jīng)元培養(yǎng)到第3天，換液時分別用濃度為0.008，0.04，0.2，1.0，5.0 mmol/L的連二亞硫酸鈉進行缺氧處理，每個濃度重復(fù)7個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明向已處理好的96孔板中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。450 nm波長下，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值（A值）。計算細胞存活率（%）=100%×（各實驗組A值/細胞對照組A值）［6］。

1.2．3天麻素處理神經(jīng)元培養(yǎng)到第3天進行氧化損傷時，加入含等量和倍量天麻素的連二亞硫酸鈉培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按細胞損傷相同方法另行計算細胞存活率。

1.3數(shù)據(jù)處理培養(yǎng)后的神經(jīng)元分為對照組（不處理），缺氧損傷組（用連二亞硫酸鈉進行化學(xué)缺氧損傷），天麻素低劑量組（與連二亞硫酸鈉等量的天麻素處理后再行缺氧損傷）和天麻素高劑量組（連二亞硫酸鈉倍量的天麻素處理后再行缺氧處理），重復(fù)觀察各組皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，以存活率平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進行計量，單因素方差分析比較組內(nèi)和組間存活率差異的顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的缺氧損傷不同濃度的連二亞硫酸鈉造成皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧損傷（圖1）有顯著的時間依賴性（圖2）和劑量依賴性（圖3），尤以高濃度連二亞硫酸鈉的損傷明顯。但1.0 mmol/L和5.0 mmol/L連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的缺氧損傷并無顯著性差異［7］。

2．2天麻素對皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷的保護作用等量或倍量的天麻素處理都能顯著改善1.0 mmol/ L連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷。高低劑量組間的作用并無顯著性差異。見表1。

表1　天麻素對皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧后細胞存活率的保護作用

圖1　連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷

圖2　1．0 mmol/L連二亞硫酸鈉致缺氧損傷的時間依賴性

圖3　連二亞硫酸鈉致缺氧損傷的濃度依賴性

3　討論

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)與功能單位，其對缺氧非常敏感，缺氧本身可造成神經(jīng)元的損傷。缺氧是中樞損傷的常見原因。體外誘發(fā)缺氧損傷的辦法有物理損傷和化學(xué)損傷?；瘜W(xué)誘發(fā)細胞損傷具有便于定量的優(yōu)點，本實驗用連二亞硫酸鈉作用于培養(yǎng)Wistar大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，體外模擬神經(jīng)元缺氧性損傷。實驗中采用方便、快速、靈敏的CCK-8試劑盒結(jié)合酶標(biāo)儀來檢測目標(biāo)產(chǎn)物的吸光值A(chǔ)，因為目標(biāo)產(chǎn)物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，所以該吸光值A(chǔ)可間接反映活細胞數(shù)量。實驗結(jié)果表明，連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的皮質(zhì)神經(jīng)元損傷具有明顯的時間依賴性和濃度依賴性。用等量或倍量的天麻素培養(yǎng)受損的皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)與對照組相比兩個劑量的天麻素組能顯著改善1.0 mmol/L連二亞硫酸鈉導(dǎo)致的皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷。

天麻是一種名貴中藥，有效成分為天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、香草醛和天麻多糖等多種成分。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)天麻多糖可能是通過清除過量的自由基，降低膜脂過氧化產(chǎn)物的含量，從而起到抗氧化的作用。此外也有實驗證實，天麻的抗氧化作用與強抗氧化劑維生素C的效果相當(dāng)［8］。天麻素是臨床上常用的神經(jīng)系統(tǒng)用藥，此前有多篇報道指出天麻素具有抗氧化的作用，但其作用機制不十分清楚［2，9］。目前的結(jié)果表明，天麻素具有對抗中樞缺氧損傷的作用，但是具體天麻中何種成分發(fā)揮該作用，以及天麻素對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧損傷的保護作用機制還需進一步研究。

［1］陽明，龐邦斌，銀勝高.天麻傳統(tǒng)規(guī)格等級與化學(xué)成分研究進展［J］.海峽藥學(xué)，2015，27（3）：42.

［2］Chen PJ，Sheen LY.Gastrodiae Rhizoma：a review of biological activity and antidepressant mechanisms［J］.J Tradit Complement Med，2011，1（1）：31-40.

［3］于穎，樊光輝.天麻素的臨床應(yīng)用研究進展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（9）：1117.

［4］田春梅.天麻的藥理學(xué)研究進展［J］.哈爾濱醫(yī)藥雜志，2010，30（4）：71-72.

［5］胡金林.天麻的藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥雜志，2009，16（3）：76，81.

［6］徐靜，孫長凱，馬輝.銀杏葉提取物及銀杏內(nèi)酯B對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元損傷的保護作用比較［J］.中國中藥雜志，2010，35（1）：114-117.

［7］石瑞麗，胡金鳳，孔令雷，等.瓜子金皂苷己對連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復(fù)供誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（3）：333.

［8］黃麗亞，崔顯念.天麻和維生素C對氟哌啶醇致衰老大鼠抗氧化酶表達作用的研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2006，26（2）：1360-1361.

［9］Li M，Hu J，Li G，et al.The antagonism of rhizoma gastrodiae to lead-induced damage of hippocampus in rats［J］.Zhonghua Laodong Weisheng Zhiyebing Zazhi，2002，20（5）：331-333.［2015-12-17收稿，2016-01-15修回］

［本文編輯：劉一洋］

R282.7

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10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.020

271000山東泰安，解放軍88醫(yī)院（袁紅英，王永清）；264200山東威海，威海市市立醫(yī)院藥劑科（王中師）

王永清，Email：WYQ96307@126.com