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        中藥多糖對(duì)免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞群影響的差異研究*

        2016-08-30 10:03:22胡明華馬方勵(lì)溫如燕鄭彥懿
        實(shí)用醫(yī)藥雜志 2016年7期
        關(guān)鍵詞:環(huán)磷酰胺免疫抑制空白對(duì)照

        羅 霞,胡明華,馬方勵(lì),溫如燕,鄭彥懿,周 聯(lián)

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        中藥多糖對(duì)免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞群影響的差異研究*

        羅霞,胡明華,馬方勵(lì),溫如燕,鄭彥懿,周聯(lián)*

        目的比較巴戟天多糖(BJT)、酒黃精多糖(JHJ)、淫羊藿多糖(YYH)、人參多糖(RS)、黃芪多糖(HQ)、何首烏多糖(HSW)、生地多糖(SD)、枸杞多糖(GQ)對(duì)免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞型影響的差異。方法采用環(huán)磷酰胺腹腔注射制成免疫抑制小鼠模型,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)T細(xì)胞比例及分型。結(jié)果給予環(huán)磷酰胺后,與正常組比小鼠外周血中CD3+T細(xì)胞比值明顯升高(P<0.01),YYH,高劑量HQ,低、高劑量RS、HSW、SD、GQ多糖對(duì)CD3+T細(xì)胞比值具有恢復(fù)作用(P<0.05);多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致Th1/Th2平衡失調(diào)具有恢復(fù)作用,其中YYH低劑量組,RS、HQ、JHJ、GQ低、高劑量組,HSW、SD高劑量組與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而JHJ、GQ低、高劑量,HSW、SD高劑量多糖對(duì)Th2的影響較明顯;此外,低、高劑量BJT、YYH、RS、GQ多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致Treg比例減少有恢復(fù)作用,與模型相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論補(bǔ)益類(lèi)中草藥多糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡的作用,在這一過(guò)程中,性味不同中藥來(lái)源的多糖可能通過(guò)作用于不同的免疫細(xì)胞起作用,滋補(bǔ)陰血中藥的多糖免疫調(diào)節(jié)活性主要偏向于Th2細(xì)胞,溫補(bǔ)陽(yáng)氣中藥的多糖對(duì)Treg細(xì)胞作用較明顯。

        中藥多糖;免疫抑制;T細(xì)胞亞群

        [Abstract]ObjectiveTo compare the differences of morinda polysaccharide(BJT),wine sibiricum(JHJ),epimedium(YYH),ginseng polysaccharides(RS),astragalus polysaccharide(HQ),polygonum polysaccharide(HSW),habitatpolysaccharide(SD),andlyciumbarbarumpolysaccharide(GQ)inaffectingonTcellsubsetin immunosuppressed mouse.MethodsImmunosuppressed mice model was made by intraperitoneal injection of cyclophosphamide,the ratio and subtype of T cell were detected by flow cytometry(FCM).ResultsAfter administration of cyclophosphamide,the ratio of CD3 cells in peripheral blood in mice was significantly higher(P<0.01);compared with the control group,low dose of YYH,high dose of HQ,low and high dose polysaccharide of RS,HSW,SD,GQ had a recovery ratio effect on CD3 cell(P<0.05);polysaccharides had recovery ratio effect on Th1/Th2 imbalance induced bycyclophosphamide,which the difference was statistically significant in low and high dose polysaccharide of YYH,RS,HQ,JHJ,GQ,high dose polysaccharide of HSW,SD compared with the model(P<0.05);however,low and high dose polysaccharide of JHJ,GQ,high dose polysaccharide of HSW,SD had an obvious effect on Th2;in addition,low and high dose polysaccharide of BJT,YYH,RS,GQ had a recovery ratio effect on Treg induced by cyclophosphamide,compared with the model group,the difference was statistically significant(P<0.05,or P<0.01).ConclusionTonic Chinese herb polysaccharides have effect of regulating the balance of immune system,in this process,the function of polysaccharide derived from Chinese medicine with differentproperties and taste reflected in effecting on difference immune cell,and the immunoregulatory activity of polysaccharides derived from Chinese medicine with nourishing Yin and blood is mainly related to Th2 cells,in addition,the polysaccharides derived from Chinese medicine with warming Yang-qi have obvious effect on Treg cell.

        [Key words]Polysaccharide;Immunosuppress;T-cell subset

        性味是中藥的重要屬性和用藥基礎(chǔ),基于中藥多糖HPLC圖譜的寒熱屬性分析發(fā)現(xiàn)[1],中藥多糖成分與其寒熱藥性存在相關(guān)性,中藥多糖成分在一定程度上可以反映其性味。多糖不僅參與細(xì)胞的生命活動(dòng),也是機(jī)體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)。作為中藥的主要活性成分之一,在中藥發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能方面尤為重要。由此衍生出來(lái)的抗腫瘤、抗炎、抗病毒,以及抗氧化等藥理作用中,不同中藥提取的多糖不盡相同[2,3]。此外,也發(fā)現(xiàn)部分多糖的免疫抑制作用[4]。由此可見(jiàn),中藥多糖生物學(xué)活性的差異與其來(lái)源有關(guān)。鑒于此,本研究選擇了部分滋陰和補(bǔ)陽(yáng)中藥提取的多糖,通過(guò)免疫抑制小鼠模型,觀(guān)察不同性味來(lái)源中藥的多糖成分對(duì)T細(xì)胞亞群的影響,以探究不同中藥性味在免疫活性上的差異。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)BALB/c小鼠,體重18~22 g,雌雄各半,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為:空白對(duì)照組;免疫抑制模型組;巴戟天多糖低、高(BJTL、BJTH)劑量組;酒黃精多糖低、高(JHJL、JHJH)劑量組;淫羊藿多糖低、高(YYHL、YYHH)劑量組;人參多糖低、高(RSL、RSH)劑量組;黃芪多糖低、高(HQL、HQH)劑量組;何首烏多糖低、高(HSWL、HSWH)劑量組;生地多糖低、高(SDL、SDH)劑量組;枸杞多糖低、高(GQL、GQH)劑量組。以上各組每組動(dòng)物10只。

        1.2主要試劑及儀器環(huán)磷酰胺:山西普德藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)04131204;CD3-FITC:Biolegend公司產(chǎn)品,批號(hào)B172735;CD4-PE:BioLegend公司產(chǎn)品,批號(hào)B180856;CD8a-PEcy5:BioLegend公司產(chǎn)品,批號(hào)B187949;CD69-PE:eBioscience公司產(chǎn)品,批號(hào):E01331-1631。IL-4-PE:Biolegend公司產(chǎn)品,批號(hào):B172983。INF-γ-FITC:Biolegend公司產(chǎn)品,批號(hào):B162926。Treg&kit:eBioscience公司產(chǎn)品,批號(hào)E09666-1646。MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱:日本SANYO公司;酶標(biāo)儀:美國(guó)THERMO公司;FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀:美國(guó)BD公司。

        1.3實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1動(dòng)物模型制作免疫抑制小鼠模型采用腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg,連續(xù)2 d,并于末次注射給藥后第5天測(cè)定指標(biāo)。以成人口服的等效劑量為低劑量(表1),等效劑量的2倍為高劑量,每天按0.2 ml/10 g體重灌胃給藥1次,連續(xù)20 d,空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

        1.3.2不同多糖對(duì)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻,用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度106個(gè)/ml,分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PEcy5染色后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        1.3.3不同多糖對(duì)Th1、Th2及其比例的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻,用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2× 106/ml,按200 μl/孔接種于96孔版。加入8 μl(25×)PMA/Ionomycin混合液,振蕩混勻后,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育完成后用PBS洗細(xì)胞,去上清后,用剩余PBS重懸,將其中一樣品管分為A、B,將B管作為樣品管的同型對(duì)照管。每管加入100 μl Fix&Perm中的Reagent A(固定液),混勻,室溫避光孵育15 min。加2 ml PBS,300 g,4℃,離心10 min去上清后,用剩余PBS重懸,加入100 μl Fix&Perm中的Reagent B(破膜液),同時(shí)破膜質(zhì)控管加入Anti-mouse CD69-PE,樣品同型對(duì)照管加入Mouse IgG1κIsotype Control-FITC,其余樣品管加入Anti-mouse INF-γ-FITC以及Anti-mouse IL-4-PE。室溫避光孵育40 min。加2 ml PBS,300 g,4℃,離心10 min上清,各加入400 μl PBS重懸,上機(jī)檢測(cè)。

        1.3.4不同多糖對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T,Treg)的影響摘眼球取小鼠眼眶靜脈血于肝素鈉抗凝管中搖勻,用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。取制備好的100 μl細(xì)胞懸液于流式管中,加入Anti-mouse CD4-FITC和Anti-mouse CD25-APC。4℃孵育30 min。加入2 ml預(yù)冷的PBS重懸,300 g,4℃,離心10 min。去上清,重懸細(xì)胞后加入1 ml新鮮配制的固定/破膜工作液,并再次旋渦混勻。室溫避光孵育30 min后,加入2 ml破膜緩沖液工作液,300 g,4℃,離心10 min。去上清液,用剩余液輕輕振蕩后,加入Anti-mouse Foxp3-PE,同型對(duì)照管加Anti-mouse Rat lgG2a-PE,室溫避光孵育30 min。加入2 ml破膜緩沖工作液洗滌細(xì)胞,離心后棄去上清,加200 μl Flow Cytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)并分析。

        1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.18種多糖對(duì)免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影響給予環(huán)磷酰胺后,小鼠外周血中CD3+細(xì)胞比值明顯升高,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5];與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在此模型基礎(chǔ)上,給予供試多糖,CD3+細(xì)胞比值升高,其中YYHL、RSLH、HQH、HSWLH、SDLH、GQLH與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而,環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞比例及其比值沒(méi)有顯著影響,給予不同多糖后,也沒(méi)有明顯變化(表1)。

        2.28種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響給予環(huán)磷酰胺后,小鼠外周血中Th1/Th2細(xì)胞比值明顯降低,表現(xiàn)為向Th2漂移,Th1/Th2細(xì)胞平衡被打破,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。這一差異與空白對(duì)照組比較有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在此模型基礎(chǔ)上,給予供試多糖,Th1/Th2細(xì)胞比值升高,二者的平衡在各多糖組均有不同程度地恢復(fù),其中YYHH、RSLH、HQLH、JHJLH、HSWH、SDH、GQLH與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01)。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),相對(duì)Th1細(xì)胞而言,JHJLH、HSWH、SDH、GQLH對(duì)Th2的影響更為顯著,而YYHH、RSLH、HQLH則對(duì)Th1、Th2的影響沒(méi)有明顯區(qū)別(表2)。

        表1 8種多糖對(duì)免疫抑制小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+及其比值的影響(x±s,n=8)

        表2 8種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響(±s,n=8)

        表2 8種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Th1、Th2的影響(±s,n=8)

        注:與空白對(duì)照組比較,△P<0.05,▲P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,#P<0.01。

        組別劑量(mg/kg)IFN-γ(%)IL-4(%)Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)空白對(duì)照等體積蒸餾水2.59±0.700.40±0.136.74±1.47模型等體積蒸餾水2.64±0.600.55±0.16△4.90±0.67▲B(niǎo)JTL801.73±0.21#0.33±0.01*5.42±1.27 BJTH1601.50±0.51#0.32±0.13#5.25±2.09 YYHL501.52±0.23*0.30±0.10*5.53±2.10 YYHH1001.50±0.47*0.26±0.08*5.93±1.27*RSL1602.25±0.770.43±0.215.70±1.05*RSH3202.35±0.430.43±0.135.89±1.53*HQL1502.36±0.380.43±0.105.68±1.11*HQH3002.32±0.530.40±0.226.69±2.38*JHJL2001.65±0.89*0.29±0.15#5.23±2.14*JHJH4001.63±0.34*0.26±0.07#6.50±1.69#HSWL1602.46±0.710.46±0.175.61±0.99 HSWH3203.00±0.420.50±0.156.48±2.04*SDL2002.20±0.400.44±0.074.96±0.52 SDH4002.10±0.430.36±0.08*6.00±1.21*GQL1601.93±0.48*0.34±0.05#5.57±0.68*GQH3202.11±0.430.36±0.13*6.33±1.53*

        2.38種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Treg細(xì)胞的影響

        給予環(huán)磷酰胺后,小鼠外周血中Treg細(xì)胞比值明顯降低,這一差異與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,8]。在此模型基礎(chǔ)上,給予供試多糖后發(fā)現(xiàn),Treg細(xì)胞比值升高,其中BJTLH、YYHLH、RSLH、GQLH與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01)。見(jiàn)表3。

        3 討論

        成熟的T細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的異質(zhì)性群體,根據(jù)其表面分子表達(dá)的差異可以分成不同的亞型。其中,根據(jù)CD分子表達(dá)不同可將成熟T細(xì)胞分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞;CD4+T細(xì)胞又可依據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同又分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞,以及Treg和Th17細(xì)胞等。T細(xì)胞不同的亞型的功能各異,正常情況下,機(jī)體各亞群數(shù)量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),一旦平衡被打破,可能引發(fā)疾病,這也是中藥多糖調(diào)節(jié)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[9,10]。與多糖免疫調(diào)節(jié)相關(guān)研究較多的亞群主要包括CD4+T、CD8+T、Th1、Th2以及Treg細(xì)胞等。

        CD4+T細(xì)胞識(shí)別MHCⅡ類(lèi)分子提呈的抗原肽,激活后通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng),起誘導(dǎo)和輔助作用;CD8+識(shí)別靶細(xì)胞表面抗原肽-MHCI類(lèi)分子復(fù)合物,活化后具有直接殺傷效應(yīng)。CD4+與CD8+T細(xì)胞亞群間的平衡,對(duì)維持機(jī)體的免疫功能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中給予環(huán)磷酰胺后,T細(xì)胞比例明顯升高,這與其作用機(jī)制有關(guān)。環(huán)磷酰胺以抑制B細(xì)胞為主,很自然地表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞比例的升高,由此并結(jié)合實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重、臟器指數(shù)等(與空白對(duì)照組相比明顯降低,數(shù)據(jù)未列出)變化可以看出,本實(shí)驗(yàn)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型造模成功。環(huán)磷酰胺對(duì)CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比例及其比值影響不大,給予多糖后,對(duì)T細(xì)胞比例均有的明顯恢復(fù)作用,說(shuō)明其對(duì)環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制具有改善作用。

        表38 種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Treg細(xì)胞的影響(±s,n=8)

        表38 種多糖對(duì)免疫抑制小鼠Treg細(xì)胞的影響(±s,n=8)

        注:與空白對(duì)照組比較,▲P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,#P<0.01

        組別劑量(mg/kg)CD4+CD25+Foxp3+(%)空白對(duì)照等體積蒸餾水4.79±0.63模型等體積蒸餾水3.26±0.45▲B(niǎo)JTL804.33±0.83#BJTH1604.35±0.77#YYHL504.41±1.11*YYHH1004.34±0.89*RSL1604.43±0.67#RSH3204.44±0.64#HQL1503.57±0.75 HQH3003.40±0.44 JHJL2003.91±0.81 JHJH4003.46±0.82 HSWL1603.69±0.82 HSWH3203.27±0.49 SDL2003.57±0.58 SDH4003.93±0.54 GQL1604.61±0.77#GQH3203.71±0.36*

        Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)的殺傷作用,激活巨噬細(xì)胞殺滅細(xì)胞內(nèi)病原體(包括病毒和細(xì)菌)以及輔助B細(xì)胞產(chǎn)生與吞噬作用有關(guān)的抗體等,其功能亢進(jìn)是引發(fā)器官特異性自身免疫疾病及急性排斥反應(yīng)的重要原因[11];Th2細(xì)胞主要參與體液免疫,抵御細(xì)胞外病原體和介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng),輔助IgG亞類(lèi)轉(zhuǎn)化為IgG1、IgE和IgA,負(fù)責(zé)非吞噬作用的宿主防御功能。Th1/Th2細(xì)胞的平衡狀態(tài)是免疫功能的重要考察指標(biāo),兩種細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子作用的相互促進(jìn)和制約使機(jī)體處于免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)平衡,既能清除抗原性異物,又不至于損傷自身組織。本實(shí)驗(yàn)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致免疫抑制時(shí),其Th1/Th2平衡明顯被打破,給予多糖后,小鼠外周血Th1/Th2平衡明顯恢復(fù),YYHH對(duì)Th1細(xì)胞較明顯的作用,JHJLH、HSWH、SDH、GQLH對(duì)Th2細(xì)胞的作用顯著。以上研究說(shuō)明,不同中藥來(lái)源的多糖在調(diào)節(jié)免疫平衡時(shí)對(duì)Th1、Th2細(xì)胞的作用有差異。

        調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能,在維持自身耐受和避免罹患自身免疫性疾病中起著極其重要的作用。天然的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(即nTreg)主要表達(dá)CD4+、CD25以及其特征性標(biāo)志Foxp3分子,通過(guò)這幾種分子可以鑒定nTreg[12]。在環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠模型中,其外周血Treg細(xì)胞明顯減少,BJTLH、YYHLH、RSLH和GQLH對(duì)小鼠Treg細(xì)胞比例的明顯恢復(fù)表明這些多糖有助于維持機(jī)體自身穩(wěn)定。

        多糖JHJ、HSW、SD、GQ來(lái)源于中藥黃精、何首烏、生地、枸杞子,藥性平和,均具有滋補(bǔ)陰血,扶正補(bǔ)虛的功效;多糖BJT、YYH、RS來(lái)源于中藥巴戟天、淫羊藿、人參,藥性甘溫,均具有溫補(bǔ)益陽(yáng)氣的功效。前者在恢復(fù)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠Th1/Th2平衡的過(guò)程中,對(duì)Th2細(xì)胞的作用顯著;后者對(duì)環(huán)磷酰胺所致Treg減少恢復(fù)明顯。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn),結(jié)合多糖為中藥性味主要的物質(zhì)基礎(chǔ)這一特點(diǎn)可以看出,這四味具有滋補(bǔ)陰血作用的中藥來(lái)源的多糖免疫調(diào)節(jié)活性主要與其調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞有關(guān);另外四味相對(duì)于滋補(bǔ)陰血作用中藥來(lái)源的多糖,具有溫補(bǔ)陽(yáng)氣作用中藥來(lái)源的多糖則偏重于對(duì)Treg細(xì)胞作用。然而本研究只從免疫平衡角度研究中藥性味分類(lèi),僅僅是一個(gè)初步探討,如若總結(jié)比較完善的規(guī)律,還需要進(jìn)行更大樣本量的研究。

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        [本文編輯:劉一洋]

        Different impacts of polysaccharides from Chinese materia medica on T-cell subsets in immuno-suppressed mice

        LUO Xia①,HU Ming-hua,MA Fang-li,et al.①School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of TCM and Materia Medica,Guangzhou,Guangdong 510006,China

        R284.1

        A

        10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.019

        廣東省教育廳科研項(xiàng)目基金資助(2013LYM0014)

        510006廣東廣州,廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(羅霞,溫如燕,鄭彥懿,周聯(lián));510623廣東廣州,無(wú)限極(中國(guó))有限公司(胡明華,馬方勵(lì))

        周聯(lián),Email:zl@gzucm.edu.cn

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