李大鵬，呂春雷，王永清，王鳳嬌，張　霞，翟真真，鄭文哲

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

創(chuàng)傷性失血性休克對機體抗氧化水平影響的實驗研究*

李大鵬，呂春雷*，王永清，王鳳嬌，張霞，翟真真，鄭文哲

目的探討創(chuàng)傷性失血性休克（traumatic hemorrhagic shock，THS）對機體過氧化水平的影響。方法選擇普通級新西蘭兔11只，通過急性失血方式建立收縮壓下降曲線，形成THS動物模型，在不同的休克時段測定收縮壓基礎(chǔ)值（T1），當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、基礎(chǔ)值1/2（T3）、基礎(chǔ)值1/3（T4）時采集血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附分析檢測各位置血清過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）水平，并予以統(tǒng)計分析。結(jié)果CAT：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間無顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；GSH-Px：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1、T2間無顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；T-AOC：各時間水平間無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論選擇收縮壓下降曲線建立THS模型，THS發(fā)生過程對機體抗氧化酶CAT、GSH-Px具有顯著性影響，可致CAT、GSH-Px活性顯著下降，但對T-AOC無顯著性影響，失血量與CAT、GSH-Px指標間存在顯著相關(guān)性。

創(chuàng)傷性失血性休克；抗氧化水平；抗氧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化物酶；總抗氧化能力

［Abstract］ObjectiveTo study the influence of traumatic hemorrhagic shock（THS）on peroxidation levels of organism.MethodsThe THS model with gradient decerease in the systolic blood pressure was eatablished in 11 New Zealand rabbits（ordinary grade）.The arterial blood at the different phases of shock，i.e.when the decreased systolic pressures were 2/3（T2），1/2（T3），1/3（T4）of the basis systolic blood pressure，was sampled，then hydrogen peroxide enzyme（CAT），glutathione peroxidase（GSH-Px），total antioxidant capacity（T-AOC）levels in the plasmaweredeterminedbythedoubleantibodySandwichmethodofenzyme-labeledimmunosorbentassay（ELISH），and be statistically analysed.ResultsCAT：Group A was higher than group B，group B higher than group C，group C higher than group D；there was no significant difference between T1-T2，T2-T3，T3-T4among all groups（P＞0.05）.But there were significant differences among the other groups（P＜0.05）.GSH-Px：Group A was higher than group B，group B higher than group C，group C higher than group D；there was no significant difference between T1-T2among all group（P＞0.05）.But there were significant differences among other groups（P＜0.05）.T-AOC：There was no significant difference between all time-level（P＞0.05）.ConclusionIn selecting the systolic blood pressure decline curve toestablishTHSmodel，THSprocesshasasignificant effect onthe antioxidant enzyme CAT and GSH-Px of organism，can lead to significantly decreased of CAT and GSH-Px activity，but has no significant effect on the T-AOC；there are significantly correlation between blood loss and CAT，GSH-Px index.

［Keywords］Traumatichemorrhagicshock；Antioxidantlevels；Antioxidantenzyme；Hydrogenperoxide enzyme；Glutathione peroxidase；Total antioxidant capacity

創(chuàng)傷性失血性休克（traumatic hemorrhagic shock，THS）是院前急救中常見的急危重癥，微循環(huán)障礙是失血性休克所有監(jiān)測指標中的核心評判標準［1］。筆者通過快速失血形成收縮壓下降曲線方式建立THS模型，以抗氧化酶系統(tǒng)中過氧化氫酶（hydrogen peroxide enzyme，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）為監(jiān)測指標，探討THS發(fā)生過程中不同失血量對機體抗氧化水平的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗對象隨機選擇新西蘭兔（n=11），普通級，體重質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，購于山東省濟南實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2015-0001］，普通環(huán)境［SYXK（軍）2012-0044］中沖洗式飼養(yǎng)兔籠（蘇州馮氏實驗動物設(shè)備公司）內(nèi)飼養(yǎng)，自由進食及飲水。

1.2主要儀器與試劑ZH-HX-2型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）用于血流動力學(xué)指標監(jiān)測，小動物人工呼吸機（上海奧爾科特生物科技公司）用于輔助呼吸等。

測定CAT、GSH-Px、T-AOC指標主要儀器包括722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠，CAT測定為波長405 nm、0.5 cm光徑比色杯，GSH-Px測定波長412 nm、1 cm光徑比色杯，T-AOC檢測波長520 nm、1 cm光徑比色杯）、5415R臺式冷凍小型離心機、5810R臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）等。CAT、GSH-Px、T-AOC測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

實驗主要耗材：0.3%戊巴比妥鈉溶液（自配），肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號1507104），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號2015092407），一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司，批號150304）等。

1.3實驗方法

1.3.1動物實驗新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d以上進行實驗，實驗前24 h禁食、2～3 h禁水。

實驗操作前，實驗兔均先稱重并記錄，并采集血標本2ml以上待檢（常規(guī)方法迅速分離血清，-80℃保存）。選擇0.3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為30 mg/kg體重，緩慢耳緣靜脈注射。根據(jù)實驗情況，麻醉過程可逐步追加1/5量，實驗中出現(xiàn)呼吸暫停者給予輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)。

麻醉穩(wěn)定后，將實驗兔仰臥固定在解剖臺上，8%硫化鈉脫毛暴露手術(shù)區(qū)皮膚后常規(guī)消毒，手術(shù)方式仔細分離出兔右側(cè)頸總動脈，完畢后插入肝素化動靜脈插管并用縫合線固定好，肝素化抗凝（500 U/ kg），插管通過壓力轉(zhuǎn)換器與無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)相連，監(jiān)測血壓、心率等血流動力學(xué)指標變化。無菌操作下，按以上方式分離出右側(cè)股動脈進行PE套管插管并用縫合線固定好以建立放血通路，并與一次性使用塑料血袋（或帶刻度定量收集管）相連，用于放血及血液標本留取。

1.3.2實驗?zāi)Ｐ椭苽鋵嶒灢僮髑?，記錄實驗兔收縮壓基礎(chǔ)值（T1）等指標。選擇右側(cè)股動脈建立的放血通路進行放血，使用一次性使用塑料血袋收集，兔收縮壓隨放血量增加而逐步下降，形成收縮壓下降曲線。當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、1/2（T3）、1/3（T4）3個位置時，通過帶刻度定量收集管分別留取血標本2 ml以上，按常規(guī)方法迅速分離血清，-80℃保存待檢。

1.4指標測定CAT活性測定采用可見光法，嚴格按試劑盒操作說明書要求進行標準品處理和實驗操作，405 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為0.2～24.8 U/ml。

GSH-Px活性測定采用DTND顯色法，嚴格按試劑盒操作說明書要求進行標準品處理和實驗操作，412 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為20～330 U/ml。

T-AOC測定采用鐵還原-菲啉顯色法，嚴格按試劑盒操作說明書要求進行標準品處理和實驗操作，520 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為0.2～55.2 U/ml。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）形式表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理。重復(fù)測量資料使用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

11只實驗兔在T1～T4共4個位置采集血樣，檢測取得血清CAT、GSH-Px、T-AOC指標數(shù)據(jù)，分別按A、B、C、D進行分組，A～D各組指標分別進行統(tǒng)計學(xué)分析。

（1）CAT、GSH-Px、T-AOC檢測結(jié)果見表1，其中CAT檢測A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，GSH-Px檢測A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T-AOC檢測A組低于B組、B組高于C組、C組低于D組。

表1　各組CAT、GSH-Px、T-AOC檢測結(jié)果

（2）統(tǒng)計學(xué)分析比較中，重復(fù)測量因素為時間因素，有T1、T2、T3、T4共4個水平。

CAT：檢測數(shù)據(jù)進行球型檢驗，結(jié)果P=0.053＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗方法無須ε校正，結(jié)果見表2；對重復(fù)效應(yīng)進行方差分析（F檢驗），結(jié)果見表3，表明各時間水平間存在顯著性差異（P＜0.001）。采用LSD法對各時間水平間進行多重比較，結(jié)果見表4，其中T1-T2、T2-T3、T3-T4各組檢驗結(jié)果P＞0.05，其余各組間均P＜0.05，表明T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間無顯著性差異，其他組間存在顯著性差異。

GSH-Px：檢測數(shù)據(jù)進行球型檢驗，結(jié)果P= 0.257＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗方法無須ε校正，結(jié)果見表2；對重復(fù)效應(yīng)進行方差分析（F檢驗），結(jié)果見表3，表明各時間水平間存在顯著性差異（P＜0.001）。采用LSD法進行各時間水平間多重比較，結(jié)果見表5，T1-T2間檢驗結(jié)果P＞0.05，其余各組間均P＜0.05，表明T1、T2間無顯著性差異，其余組間存在顯著性差異。

表2　球型檢驗結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

表4　CAT不同時間水平下LSD多重比較結(jié)果

表5　GSH-Px不同時間水平下LSD多重比較結(jié)果

T-AOC：檢測數(shù)據(jù)進行球型檢驗，結(jié)果P= 0.110＞0.05，不拒絕球形假設(shè)，應(yīng)用單變量檢驗方法無須ε校正，結(jié)果見表2；對重復(fù)效應(yīng)進行方差分析，結(jié)果見表3，表明各時間水平間無顯著性差異（P=0.103＞0.05）。

3　討論

失血性低血容量休克主要病理生理改變是有效循環(huán)血容量急劇減少及微循環(huán)障礙，可導(dǎo)致組織低灌注、再灌注損傷等［2］。氧化應(yīng)激是機體最常見的應(yīng)激反應(yīng)之一，系指在損傷因素作用下，機體組織或細胞內(nèi)氧自由基生成增多和（或）清除能力降低，導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化及造成細胞或組織氧化損傷［3，4］。

抗氧化酶是機體抗氧化系統(tǒng)的主要組成。CAT可有效清除自由基、減輕及阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、還原體內(nèi)不斷生成的過氧化氫、產(chǎn)生保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整等作用，可間接反映抗氧化酶的活性及機體清除自由基的能力；GSH-Px作為清除自由基的抗氧化制劑，可還原體內(nèi)不斷生成的脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫，減少活性氧自由基及脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，清除自由基和衍生物，增強機體抗氧化能力，防止脂質(zhì)過氧化物對機體組織造成損害，產(chǎn)生保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。T-AOC是衡量抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，其含量能反映機體抗氧化系統(tǒng)針對外來刺激的代償能力及自由基代謝的狀況［5-11］。

機體抗氧化酶系統(tǒng)及抗氧化水平易受到多種因素影響［11，12］。筆者建立的THS模型，存在研究THS發(fā)生過程對機體抗氧化水平的影響。檢測數(shù)據(jù)表明：隨THS發(fā)生過程中失血量逐步增加，抗氧化酶CAT、GSH-Px活性均不斷下降。CAT組間比較，T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間均無顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；GSH-Px組間比較，T1、T2間無顯著性差異（P＞0.05），其余組間存在顯著性差異（P＜0.05）；T-AOC組間比較，各時間水平間無顯著性差異（P＞0.05）。表明失血量大量增加對CAT、GSH-Px指標具有顯著性影響，可致抗氧化酶CAT、GSH-Px活性顯著下降，但對反映抗氧化系統(tǒng)功能狀況綜合性指標T-AOC則無顯著性影響。THS發(fā)生過程中失血量與CAT、GSH-Px指標活性具有顯著相關(guān)性。

實驗表明，隨著THS發(fā)生過程中有效循環(huán)血容量急劇減少及微循環(huán)障礙，可導(dǎo)致組織低灌注、再灌注損傷，使機體組織或細胞內(nèi)氧自由基生成增多，過量自由基水平可致抗氧化酶CAT、GSH-Px消耗增加，顯著降低血清中CAT、GSH-Px活性水平，使機體清除自由基能力及抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)上調(diào)，促進脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致機體生物膜損傷。

總之，筆者通過快速失血方式建立THS模型，以CAT、GSH-Px及T-AOC為監(jiān)測指標，探討及評價THS發(fā)生過程中不同失血量對機體抗氧化水平的影響，數(shù)據(jù)表明THS發(fā)生過程中不同失血量對CAT、GSH-Px指標具有顯著性影響，可顯著降低血清CAT、GSH-Px活性水平，使機體清除自由基能力及抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)上調(diào)，但對TAOC水平則無顯著性影響，為院前THS救治及相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支持。

今后仍有待于進一步增加實驗研究數(shù)量，結(jié)合開展相關(guān)生理病理等機理機制研究，并在THS復(fù)蘇救治等工作中不斷加以推廣。

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［本文編輯：韓仲琪］

Experimental study on the influences of traumatic hemorrhagic shock on antioxidant levels of organism

LI Da-peng①，LV Chun-lei，WANG Yong-qing，et al.①Central Medical Laboratory，the 88th Hospital of Chinese PLA，Taian，Shandong 271000，China

R641：R441.9

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.07.018

軍隊“十二五”后勤科研計劃項目（CWS11J297）

271000山東泰安，解放軍88醫(yī)院中心實驗室（李大鵬，王鳳嬌，張霞，翟真真），醫(yī)務(wù)處（呂春雷，王永清，鄭文哲）

呂春雷，Email：15653808901@163.com