閆慧芳，曾炳山，范春節(jié)，劉　英，裘珍飛，李湘陽

( 中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520 )

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油菜素內(nèi)酯對巨桉組培中不定根誘導(dǎo)、苗木生長和莖基部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

閆慧芳，曾炳山，范春節(jié)*，劉英，裘珍飛，李湘陽

( 中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520 )

以巨桉優(yōu)良無性系EG5和GL1組培苗為材料，在生根培養(yǎng)基中分別加入0、 0.005、0.01、0.05、0.10、0.20 mg·L-1的油菜素內(nèi)酯，研究其對桉樹組培苗中不定根的誘導(dǎo)、莖的生長以及莖基部細(xì)胞分化的影響。結(jié)果表明：油菜素內(nèi)酯對巨桉無性系EG5的生根率和苗高具有顯著影響，無性系EG5在含有0.005 mg·L-1油菜素內(nèi)酯的生根培養(yǎng)基中達(dá)到最高為76.6%的生根率，同時(shí)組培苗的苗高隨著油菜素內(nèi)酯濃度的增加而呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。對于巨桉無性系GL1，在生根培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-1油菜素內(nèi)酯達(dá)到最高為88.3%的生根率，不同濃度的油菜素內(nèi)酯對苗高沒有顯著影響。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯明顯抑制了無性系EG5不定根的根長，隨著其濃度的增加根長逐漸變短；而根條數(shù)表現(xiàn)為低濃度時(shí)無顯著影響，在高濃度時(shí)顯著性降低，且油菜素內(nèi)酯對側(cè)根的誘導(dǎo)和分化不起作用。另外通過對無性系EG5生根植株基部的組織切片和化學(xué)染色分析表明，油菜素內(nèi)酯在0.10 mg·L-1時(shí)能促進(jìn)桉樹基部的形成層和木質(zhì)部的分化，這可能是抑制不定根誘導(dǎo)和分化的原因之一。

油菜素內(nèi)酯, 桉樹, 不定根誘導(dǎo), 形成層

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteriods，BRs)是廣泛存在于植物中一種甾醇類化合物，作為一種類固醇類激素，在植物生長發(fā)育中起著不可缺少的作用。早期的研究發(fā)現(xiàn)通過外施BRs可明顯促進(jìn)胚軸的伸長、提高農(nóng)作物產(chǎn)量、提高植物抗逆性和果蔬的生長(候雷平和李梅蘭, 2001; 束紅梅等, 2011)。在火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、挪威云杉(Piceaabies)、佛羅里達(dá)榧樹(Torreyataxifolia)和水稻(Oryzasativa)的體胚誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)添加不同濃度的BRs可以促進(jìn)胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)和進(jìn)一步的分化(Ma et al, 2012; Pullman et al, 2003)。另外在培養(yǎng)基中添加不同濃度的BRs有助于狐米草(Spartinapatens)愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生(Lu et al, 2003)，而以煙草(Nicotianatabacum)葉片為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生中進(jìn)一步證實(shí)了BRs的作用(Song-Lim Kim, 2008)。

BRs除了參與到種子萌發(fā)、矮化、黑暗中光周期響應(yīng)、改變氣孔分布、延遲開花、雄性不育等發(fā)育過程中(Zhu et al, 2013)，而且還在細(xì)胞伸長和細(xì)胞壁擴(kuò)展中起到重要作用(候雷平和李梅蘭, 2001)。在百日草葉肉懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入BRs可以誘導(dǎo)維管組織的分化，同時(shí)在菊芋(Helianthustuberosus)中也發(fā)現(xiàn)BRs可以在體外誘導(dǎo)木質(zhì)部的分化(Clouse, 1996; Fukuda, 1997)。在木本植物中發(fā)現(xiàn)BRs可以誘導(dǎo)日本山楊和美洲鋸齒白楊雜交種(Populussieboldii×P.grandidentata)愈傷組織中導(dǎo)管的形成，而且這些導(dǎo)管分子具有典型的次生木質(zhì)部(Yamagishi et al, 2013)。研究也發(fā)現(xiàn)BRs能夠引起鵝掌楸(Liriodendrontulipifera)中纖維和導(dǎo)管長度的增加，促進(jìn)細(xì)胞分裂和延伸，引起木質(zhì)素合成基因的下調(diào)(Jin et al, 2014)。盡管如此，BRs對植物根發(fā)育的作用研究較少，尤其是對木本植物不定根發(fā)育的影響幾乎未見有報(bào)道。

本研究通過外源施加BRs到桉樹生根培養(yǎng)中，研究油菜素內(nèi)酯對桉樹不定根誘導(dǎo)的影響，旨在為木本植物不定根的誘導(dǎo)提供新的思路。同時(shí)通過對桉樹生根苗莖基部組織化學(xué)分析，確定BRs對桉樹莖基部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步了解其對桉樹莖生長發(fā)育的作用。

1　材料與方法

1.1 材料

采用在增殖培養(yǎng)基(改良的MS培養(yǎng)基+0.50 mg·L-16BA+0.10 mg·L-1NAA)上培養(yǎng)15 d的巨桉無性系EG5和GL1無菌增殖苗，選擇生長健壯、苗高約為1.50 cm的增殖芽苗進(jìn)行生根實(shí)驗(yàn)。

1.2 桉樹生根實(shí)驗(yàn)

材料為巨桉無性系EG5和GL1組培生根苗。分別采用改良的1/2MS培養(yǎng)基+1.00 mg·L-1IBA，同時(shí)加入0、0.005、0.01、0.05、0.10、0.20 mg·L-1表油菜素內(nèi)酯，每個(gè)處理10～15瓶，每瓶10～15株。20 d調(diào)查生根率、苗高和生長狀況。

對于桉樹根長和根條數(shù)選擇巨桉無性系EG5，在生根培養(yǎng)基中30 d后測量最長根的根長、根條數(shù)和是否有側(cè)根。

1.3 植物組織切片

選擇對照和添加0.10 mg·L-1BRs生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的巨桉EG5的基部，切取3～5 mm的莖段，立即浸入FAA固定液，抽氣 2次，每次15 min，室溫下固定24 h以上。然后依次通過逐級脫水至100%叔丁醇, 每級1.5～2 h。最后一次加入與叔丁醇等體積的石蠟，60 ℃放置24 h，期間用純石蠟替代4次。然后進(jìn)行包埋、固定和修塊，切片時(shí)采用滑走切片機(jī)切出12 μm厚度的切片,在45 ℃溫箱中過夜烤片。經(jīng)過脫蠟后甲苯胺藍(lán)O(TBO)滴染約1 min，漂洗，甘油封片，顯微鏡觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS和EXCEL軟件對生根苗各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，多重比較采用LSD最小顯著性差異法(P<0.05)，生根率在進(jìn)行方差分析前采用反正弦轉(zhuǎn)換。

2　結(jié)果與分析

2.1 BRs在巨桉無性系不定根誘導(dǎo)中的作用

不同濃度的BRs對巨桉的生根率具有顯著性影響(圖1)，在無性系GL1中，隨著BRs濃度的增加，桉樹的生根率呈現(xiàn)不同程度的增加，在外施BRs濃度為0.05 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高(88.3%)。在無性系EG5中，外施不同濃度的BRs對其生根率的影響也達(dá)到顯著水平，在外施BRs較低時(shí)如0.005、0.01和0.05 mg·L-1時(shí)，EG5的生根率顯著性增加；在BRs濃度為0.005 mg·L-1時(shí)，EG5的生根率達(dá)到最高(76.6%)。從圖1可以看出，在濃度超過0.10 mg·L-1的培養(yǎng)基中，EG5的生根率顯著下降，當(dāng)培養(yǎng)基中BRs的濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，EG5的生根率達(dá)到最低，為34.1%，明顯低于對照的57.0%，說明高濃度的BRs抑制了桉樹不定根的誘導(dǎo)。

圖 1　不同濃度的油菜素內(nèi)酯對巨桉無性系生根率的影響同一個(gè)無性系中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Fig. 1　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the rooting rate of clone E. grandis　Different small letters in the same column represent significant differences (P<0.05). The same below.

圖 2　不同濃度油菜素內(nèi)酯對巨桉生根苗高度的影響Fig. 2　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the shoot height of E. grandis

2.2 BRs對巨桉苗高的影響

通過對不同濃度BRs處理的巨桉無性系EG5和GL1的生根苗高度進(jìn)行測量，圖2結(jié)果表明EG5和GL1對不同濃度BRs響應(yīng)不同。外施BRs抑制了EG5的生長，芽苗的抽高受到明顯抑制，在0.10 mg·L-1時(shí)達(dá)到了最低(1.57 cm)，與對照相比降低了21.8%。而施加不同濃度的BRs到無性系GL1發(fā)現(xiàn)其對生根苗高度上的影響不顯著。盡管如此，仍然可以看到在加入BRs后苗高略微下降。可能是由于不同無性系之間由于莖基部結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其對油菜素內(nèi)酯的響應(yīng)濃度和響應(yīng)方式的不同。

2.3 BRs對EG5不定根根長和根條數(shù)的影響

由于在生根實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BRs對EG5生根率和高度上的影響，為了弄清是否由于根生長受到抑制引起生長上的抑制，因此對EG5的根長和根條數(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。從圖3可以看出，在30 d的生根培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)隨著BRs濃度的增高，根長出現(xiàn)明顯下降。在沒有添加BRs的培養(yǎng)基中，平均根長為4.64 cm；而在濃度為0.20 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中平均根長只有2.49 cm，說明BRs抑制了EG5不定根的伸長，這可能是BRs抑制桉樹生根苗抽高的主要原因之一。

圖 3　油菜素內(nèi)酯對巨桉EG5根長的影響Fig. 3　Effects of different concentrations of brassinosteriod on root length of E. grandis clone EG5

圖 4　油菜素內(nèi)酯對巨桉EG5根數(shù)量的影響Fig. 4　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the root number of E. grandis clone EG5

圖 5　巨桉EG5生根苗基部切片分析　 A. 對照; B. 0.10 mg·L-1 BR。線狀比例尺為0.10 mm。Fig. 5　Histochemical analysis of basal stem of E. grandis clone EG5　A. Control； B. 0.10 mg·L-1 brassinosteriod. Scale bar=0.10 mm.

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對外施BRs(濃度為0.005和0.01 mg·L-1)，并對不定根數(shù)量進(jìn)行了分析。從圖4可以看出，與對照相比，不定根的數(shù)量無明顯變化，說明低濃度BRs對EG5不定根誘導(dǎo)作用不顯著。而隨著BRs濃度的進(jìn)一步增高，不定根的數(shù)量明顯降低，由原來的平均在3條以上降低到2條以下。這些與BRs在高濃度時(shí)引起巨桉生根率降低的結(jié)果相一致，說明高濃度的BRs明顯抑制了不定根的誘導(dǎo)和形成。除此之外，通過對生根苗中側(cè)根的誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)，所有處理的不定根都有側(cè)根出現(xiàn)。這表明BRs主要通過影響桉樹不定根的誘導(dǎo)和發(fā)育來進(jìn)一步作用于桉樹的生長。

2.4 BRs對桉樹莖基部初生木質(zhì)部分化的影響

在上述研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度BRs抑制了桉樹不定根的誘導(dǎo)，為了進(jìn)一步了解其機(jī)制，因此對莖基部進(jìn)行了細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析。在外施BRs(濃度在0.10 mg·L-1)中發(fā)現(xiàn)，BRs引起桉樹基部膨脹作用最為明顯，因此在本研究中選擇外施BRs，當(dāng)外施BRs的濃度在0.10 mg·L-1時(shí)，對EG5生根苗莖基部取樣進(jìn)行石蠟切片分析。從圖5可以看出，與對照相比，韌皮部細(xì)胞數(shù)量變少，細(xì)胞變小，而薄壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞變小，同時(shí)薄壁細(xì)胞連接起來，甚至出現(xiàn)導(dǎo)管，已經(jīng)具有明顯的次生生長，另外在圖5中還可以明顯看到木質(zhì)部細(xì)胞明顯增加。

3　討論與結(jié)論

本文通過在桉樹生根培養(yǎng)基中添加不同濃度的BRs研究其對桉樹不定根誘導(dǎo)、苗高以及桉樹莖基部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明低于0.05 mg·L-1的BRs可以不同程度地提高桉樹的生根率，且對植株的高度生長影響較小甚至不受影響。因此可以通過添加適當(dāng)濃度的BRs來改善和提高木本植物組培過程中的不定根誘導(dǎo)困難的問題，這為解決木本植物生根率低的問題提供一種解決方式。

值得注意的是0.10 mg·L-1的BRs會明顯地抑制不定根的誘導(dǎo)。經(jīng)過切片分析，0.10 mg·L-1的BRs引起桉樹基部的形成層細(xì)胞增多，且木質(zhì)化程度增加。這些結(jié)果與BRs誘導(dǎo)百日草懸浮細(xì)胞形成導(dǎo)管以及BRs會引起楊樹愈傷組織誘導(dǎo)次生木質(zhì)部的形成結(jié)果一致(Fukuda, 1997; Yamagishi et al, 2013)，說明BRs對桉樹組培苗莖基部木質(zhì)化細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化起作用。在白樺(BetulaPlatyphylla)不定根誘導(dǎo)的過程中對不定根起源研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不定根起源于幼莖內(nèi)部少數(shù)維管射線細(xì)胞與形成層的交叉處加寬的部位(詹亞光等, 2002)，而在本研究中發(fā)現(xiàn)0.10 mg·L-1的BRs引起桉樹基部形成了環(huán)狀的形成層，意味著進(jìn)入了次生生長，在此過程中單獨(dú)的成團(tuán)細(xì)胞減少，引起誘導(dǎo)不定根的條件減少。說明桉樹莖基部的木質(zhì)化增加可能是不定根誘導(dǎo)受到抑制的主要原因之一。

除此之外，在研究中發(fā)現(xiàn)添加BRs明顯地抑制了不定根的伸長，與小麥和綠豆中的作用類似(Roddick & Ikekawa, 1992)。而在擬南芥中發(fā)現(xiàn)BRs在低濃度時(shí)仍然能夠促進(jìn)根的伸長(Müssig et al, 2003)，但會抑制根毛的發(fā)育。與之不同，在水稻中BRs表現(xiàn)出在一定的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)根毛的生長發(fā)育(王鳳茹和董金皋, 2010)。因此推測BRs對不定根發(fā)育的影響受到劑量調(diào)控，不同物種響應(yīng)BRs的濃度不同從而導(dǎo)致其對根發(fā)育的影響不同。

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Adventitious root induction, shoot height and cellular structure of basal stem by exogenous application of brassinosteriod inEucalyptusgrandis

YAN Hui-Fang, ZENG Bing-Shan, FAN Chun-Jie*,LIU Ying, QIU Zhen-Fei, LI Xiang-Yang

( Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China )

Brassinosteroids (BRs) refer to a group of polyhydroxylated plant steroid hormones that are essential regulators of plant architecture, growth and development including embryogenesis, cell division, vascular system differentiation and stress tolerance processes. However, the effects of BRs in adventitious root induction ofEucalyptushave not been demonstrated. In this study, adventitious root induction, growth of shoots and histochemical staining of basal stem were analyzed by adding the exogenous brassinosteriod (Concentration: 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.10, 0.20 mg·L-1,respectively) in the root inducing medium ofE.grandisclones EG5 and GL1. The results showed that the height of shoot and induction frequency of adventitious root ofE.grandisclone EG5 were significantly affected by adding the exogenous brassinosteriod. Induction frenquency of adventitious root was 76.6%. The length of adventitious root ofE.grandisclone EG5 was the highest in the root inducing medium containing 0.005 mg·L-1brassinosteriod for. In the meantime. The height of shoot decreased significantly with the increasing concentration of exogenous brassinosteriod and it was reduced by 21.8% at 0.10 mg·L-1brassinosteriod concentration compared to control. The adventitious root induction frequency ofE.grandisclone GL1 reached the highest level with 88.3% in the root inducing medium of adding 0.05 mg·L-1brassinosteriod concentration but the height of shoot showed no significant change by adding the exogenous brassinosteriod. It was interesting that the root elongation ofE.grandisclone EG5 was significantly inhibited due to the addition of the exogenous brassinosteriod. Root length and number were reduced to 2.49 cm and 1.75 at 0.20 mg·L-1brassinosteriod from 4.64 cm and 3.02(control) respectively. However, the lateral root induction and differentiation were not affected by adding the exogenous brassinosteriod. Besides, the growth in xylary cells of basal stem was clearly promoted and the cambium cell number of basal stem increased at 0.10 mg·L-1brassinosteriod by way of the histochemical analysis. Together, brassinosteriods was necessary to adventitious root induction and shoot growth and increasing xylem was a primer cause of lower frenquency of adventitious root induction at a few extra brassinosteriod.

brassinosteriod,Eucalyptusgrandis, adventitious root induction, cambium

10.11931/guihaia.gxzw201412005

2015-03-16

2016-01-25

國家自然科學(xué)基金(31400554)；國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102705)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(RITFYWZX201304)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31400554); Project of National Science and Technology Plan(2013AA102705); Special Foundamental Research Fund of the Central Research Institutes of Public Benefit (RITFYWZX201304)]。

閆慧芳(1987-)，男，陜西渭南人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)，(E-mail)huifangy@sina.com。

范春節(jié)，博士，助理研究員，從事木材形成分子機(jī)理研究，(E-mail)fancy0417@163.com。

Q943

A

1000-3142(2016)07-0763-05

閆慧芳，曾炳山，范春節(jié)，等. 油菜素內(nèi)酯對巨桉組培中不定根誘導(dǎo)、苗木生長和莖基部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響[J]. 廣西植物，2016，36(7)：763-767

YAN HF,ZENG BS,FAN CJ，et al. Adventitious root induction, shoot height and cellular structure of basal stem by exogenous application of brassinosteriod inEucalyptusgrandis[J]. Guihaia，2016，36(7)：763-767