田新華，姜天瑞，翁海龍*

(1.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省科技成果轉(zhuǎn)化中心，哈爾濱150028)

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興安落葉松的胚性愈傷組織誘導與體胚發(fā)生研究

田新華1，姜天瑞2，翁海龍1*

(1.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省科技成果轉(zhuǎn)化中心，哈爾濱150028)

對興安落葉松合子胚誘導胚性愈傷組織及體細胞發(fā)生進行研究，旨在解決落葉松無性系快速繁殖問題，對于遺傳改良以及人工種子生產(chǎn)有重要意義。研究結(jié)果表明：1/4 LP(改良)培養(yǎng)基最適宜誘導胚性愈傷組織，同時添加激素6-BA 5×10-6M、NAA 5×10-8M的培養(yǎng)基中體胚誘導率較高，誘導效果較好。

落葉松；離體培養(yǎng)；體胚發(fā)生

落葉松(Larixgemelinii)原產(chǎn)于北半球的北溫帶地區(qū)和喜瑪拉雅山脈，該屬約有18個種，分布范圍較廣，東北地區(qū)最多[1]。據(jù)統(tǒng)計，落葉松林木的蓄積量在東北地區(qū)占針葉林總蓄積量的39.4%；占黑龍江省用材林蓄積量的23.6%，其中大興安嶺林區(qū)占用材林總蓄積量的67%[2]，是我國東北地區(qū)的主要造林樹種。落葉松比松樹和云杉生長快，以早期速生、抗逆性強著稱，且落葉松木材重而堅實，抗壓及抗彎曲的強度大，而且耐腐朽，木材工藝價值較高。落葉松木纖維長，纖維的長寬比大，管胞壁厚，生產(chǎn)的紙張具有較高的強度、拉力，耐破指數(shù)高。所以大量用于建筑業(yè)、裝演業(yè)、造紙業(yè)[3-5]。但是落葉松生長周期較長，有性繁殖后代變異較大；落葉松扦插繁殖生根率很低[6]；在高寒地區(qū)的限制因素很多，所以對一些優(yōu)良性狀難以維持，大規(guī)模繁殖利用難度較大。嚴重地影響了落葉松遺傳改良的進程，限制了落葉松良種使用比率和發(fā)展速度。本研究旨在利用組織培養(yǎng)的方法更快更好地誘導出興安落葉松的胚性愈傷組織或體胚，在短期內(nèi)可以獲得大量遺傳上和形態(tài)上均一的苗木[6]，為遺傳改良以及人工種子生產(chǎn)等方面奠定堅實的基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本試驗供試材料來源于林口青山落葉松國家良種基地興安落葉松的成熟種子，分別于6月、9月、12月不同時間進行分批試驗。

1.2試驗方法

1.2.1種子的清洗與消毒。將種子用蒸餾水浸洗20min，分別采用70%酒精和0.1%HgCl2與70%酒精和3%NaClO進行滅菌處理，然后在超凈工作臺下用無菌水反復漂洗6次，每次漂洗2 min，取出種子用濾紙吸干多余水分，備用。

1.2.2基本培養(yǎng)基篩選試驗。采用眼科剪子與解剖刀剝?nèi)〕墒旆N子的合子胚為外植體，分別接種于MSG、DCR、1/4LP(改良)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。每皿培養(yǎng)2個外植體，每個處理5皿，每個處理重復3次。

1.3外植體的誘導與分化培養(yǎng)

誘導培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗無光條件進行暗培養(yǎng)，溫度控制在23±2℃。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。

分化培養(yǎng)：將胚性愈傷組織、早期體胚接種于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在23±2℃。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。

將外植體放于直徑為5cm的塑料皿內(nèi)，皿中含有培養(yǎng)基5mL。用封口膜封口，再用鋁箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒溫培養(yǎng)，30d繼代1次。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

通過統(tǒng)計愈傷組織、體細胞胚的出現(xiàn)數(shù)，分別計算出愈傷組織、體細胞胚產(chǎn)生的百分數(shù)。

體胚發(fā)生率=產(chǎn)生體胚的幼胚的數(shù)量/接種培養(yǎng)的所有胚的數(shù)量×100%。

胚性愈傷誘導率=產(chǎn)生愈傷的幼胚的數(shù)量/接種培養(yǎng)的所有胚的數(shù)量×100%。

試驗獲得的愈傷組織用解剖鏡記錄、拍照。培養(yǎng)30d統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率，采用Excel 2003和dps7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析和多重比較[7]。

2　結(jié)果與分析

2.1不同滅菌方法對胚性愈傷組織誘導的影響

外植體的消毒處理是植物組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，具體的消毒方案因植物材料和取材時期而異。對興安落葉松種子進行消毒處理，培養(yǎng)10d統(tǒng)計外植體的污染率，結(jié)果如表1所示，不同處理對外植體污染率和啟動率的影響不同。HgCl2的消毒處理導致的污染率最高，為70.0%，比NaClO消毒處理12min的污染率高2倍多；而NaClO消毒時間長短的差別不是很明顯，以消毒處理12min表現(xiàn)最好，為26.7%，因此以NaClO 消毒處理12min為興安落葉松種子表面滅菌的最佳方法。

表1　不同處理方法對興安落葉松種子滅菌效果的影響

2.2基本培養(yǎng)基對興安落葉松體胚發(fā)生啟動的影響

對6月份處理的種子進行消毒處理接種于不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過30d培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)(如表2所示)，合子胚在本試驗所采用不同基本培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生愈傷組織，但是愈傷組織的誘導率差異顯著。這說明，基本培養(yǎng)基的種類對胚性愈傷組織誘導率影響較大，其中培養(yǎng)基MSG和DCR對胚性愈傷組織的誘導率較低且差異不顯著，而與1/4LP(改良)培養(yǎng)基對胚性愈傷組織的誘導率相比差異顯著(P<0.05)。興安落葉松胚性愈傷組織誘導率以1/4LP(改良)培養(yǎng)基最高，并且培養(yǎng)基中的外植體產(chǎn)生白色、透明絲狀胚性愈傷組織。

表2　不同培養(yǎng)基上的興安落葉松

注：不相同字母表示有顯著差異(P<0.05)，下同。

2.3激素組合對興安落葉松體胚發(fā)生啟動的影響

表3　不同激素組合對興安落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

我們將不同時期所取的外植體按照下列組合進行誘導試驗。試驗結(jié)果表明，生長素與細胞分裂素的濃度配比對外植體脫分化形成愈傷組織起著關鍵的控制作用。如表3所示，隨著激素2,4-D濃度的提高，愈傷組織誘導率也隨之提高，形成有粘性且松散的愈傷組織，這說明適當?shù)奶岣?,4-D的濃度有必要的。6-BA、KT濃度增加時，也可促進愈傷組織增長，但是繼代之后發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的胚性開始喪失，這說明繼代適當?shù)馗鼡Q培養(yǎng)基來保證胚性愈傷組織的保持與增殖是有必要的。

2.4興安落葉松胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)及體胚發(fā)生的影響因素

選用1/4 LP(改良)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別附加不同濃度6-BA 、NAA進行胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

將離體胚平放于直徑為5cm的塑料皿內(nèi)，皿中含有培養(yǎng)基5mL。用封口膜封口，再用鋁箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒溫培養(yǎng)，30d繼代1次。

繼代過程中發(fā)現(xiàn)有部分白色或淺黃色愈傷組織逐漸褐化，松散狀也轉(zhuǎn)換成致密不透明，失去分化能力。隨著激素濃度的調(diào)整有部分未褐化的胚性愈傷組織逐漸誘導體胚發(fā)生，其中以濃度為6-BA 5×10-6M和NAA 5×10-8M誘導效果最好，即1/4 LP(改良)+6-BA5×10-6M+NAA 5×10-8M培養(yǎng)基中體胚誘導率較高，誘導效果較好。

3　小結(jié)

3.1在落葉松體胚發(fā)生過程中，細胞分裂素和生長素的配比對外植體脫分化形成胚性愈傷組織起著重要的調(diào)控作用。因此必須通過調(diào)整各激素濃度之間配比才更有利于體胚發(fā)生。

3.2本試驗以成熟合子胚的外植體誘導胚發(fā)生，盡管在繼代過程中褐化、死亡，但以成熟合子胚的外植體誘導落葉松體胚的發(fā)生還是可行的，今后還要繼續(xù)探索各激素的合理配比進一步提高體胚發(fā)生的誘導率。

附圖　球形胚

[1]王企明.松樹[M].南京:江蘇科學技術出版社，1994.

[2]賈治邦.中國森林資源報告：第七次全是森林資源清查[M].北京：中國林業(yè)出版社，2009.

[3]周崟.中國落葉松屬木材[M].北京：中國林業(yè)出版社，2001:171-179.

[4]李堅.木材科學[M]. 北京：高等教育出版社,2003:257-259.

[5]李堅.中國主要樹種木材物理力學性質(zhì)[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社,2006:147-154.

[6]王彥清，吳克賢，張泉.胡桃揪體細胞胚胎發(fā)生的研究[J].林業(yè)科技，2000,25(2):8-9.

[7]唐啟義,馮明光.實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京:科學出版社,2002.

Induction of Embryogenic Callus and Somatic Embryogenesis in Larix gemelinii

Tian Xinhua1，Jiang Tianrui2，Weng Hailong1*

(1.Heilongjiang Institute of Forestry Sciences,Harbin,Heilongjiang 150081;2. The center of Scientific and Technological Achievements of Heilongjiang Province,Harbin,150028)

this study zygote embryo ofLarixgemeliniiinduction of embryonic callus and somatic cells, aims to solve the problem of larch clones reproduce rapidly, has important significance for genetic improvement and artificial seed production. The results showed that the 1/4 LP (improved) medium for embryonic callus induction was suitabled, while adding hormone 6-BA 5 × 10-6m, NAA, 5 × 10-8m medium term embryo rate was higher, the induced effect was better.

Larixgemelinii；In vitro culture；Somatic embryogenesis

2016-02-18

黑龍江省屬科研院所基本科研業(yè)務費專項“落葉松無性系扦插育苗配套技術研究”資助

田新華，女，碩士，副研究員，主要從事森林培育方面研究，E-mail:tianjie1976@sina.com；*通訊作者：翁海龍，碩士，副研究員，主要從事林木育種方面研究，E-mail:dl5529@gmail.com。

S436.611

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.005