劉 璐 劉祥梅 文登臺(tái) 施 孟

(湖南師范大學(xué)體育學(xué)院, 湖南 長沙 410012）

三周游泳訓(xùn)練對小鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組的影響*

劉 璐 劉祥梅 文登臺(tái) 施 孟

(湖南師范大學(xué)體育學(xué)院, 湖南 長沙 410012）

目的:應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練對小鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組的影響。方法:20只雄性ICR小鼠分為安靜對照組(C)和游泳訓(xùn)練組(TB)。TB組三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練后48 h 和C組小鼠均取材，提取肝線粒體蛋白質(zhì)做雙向凝膠電泳并分析，取差異表達(dá)10倍以上的蛋白點(diǎn)。質(zhì)譜檢測結(jié)果：C組和TB組差異蛋白表達(dá)上調(diào)5倍以上的有25個(gè)，下調(diào)5倍以上的有6個(gè)，上調(diào)10倍以上的有5個(gè)，下調(diào)10倍以上的有1個(gè)；質(zhì)譜鑒定出結(jié)構(gòu)明確的三種蛋白為熱休克蛋白60、乙醛脫氫酶2和細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體1。結(jié)論：三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練小鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組差異表達(dá)明顯，突出地對保護(hù)線粒體和加強(qiáng)能量代謝電子傳遞過程的蛋白表達(dá)上調(diào)，這與適宜運(yùn)動(dòng)有利于肝臟的關(guān)系密切。

游泳;肝線粒體;蛋白質(zhì)組學(xué);小鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

肝臟是人體內(nèi)最大腺體和功能最復(fù)雜的器官之一，對糖、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和激素的代謝起重要作用，肝臟的機(jī)能影響著機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，而運(yùn)動(dòng)可改變肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。運(yùn)動(dòng)與肝臟的相互影響的過程中，肝線粒體的結(jié)構(gòu)和功能變化是重要原因[1]。線粒體功能最終由蛋白質(zhì)執(zhí)行，其蛋白質(zhì)組的研究在揭示疾病發(fā)病機(jī)制和治療信息中日益受到關(guān)注[2]。適宜運(yùn)動(dòng)對肝細(xì)胞有保護(hù)作用與減少線粒體能量損耗及損傷有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)采用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析輕負(fù)重游泳訓(xùn)練三周后的肝線粒體蛋白質(zhì)組差異表達(dá)及發(fā)揮特殊生物學(xué)意義的重要蛋白，探討運(yùn)動(dòng)對肝臟影響的線粒體機(jī)制，為應(yīng)用合理運(yùn)動(dòng)對肝臟保健與促進(jìn)疾病康復(fù)提供分子生物學(xué)新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與訓(xùn)練方案

20只雄性 ICR小鼠，體重 30±2 g，按體重分層隨機(jī)分為安靜對照組(C)和游泳訓(xùn)練組(TB)。TB組放入水溫28±2 ℃、水深 40 cm的桶內(nèi)游泳，一周不負(fù)重 30分鐘，二周尾根部2%負(fù)重40分鐘，三周3%負(fù)重40分鐘。每周五天，進(jìn)行三周。

1.2 取材與樣品制備

TB組訓(xùn)練48 h后，與C組均稱重麻醉，摘取右肝前葉，提肝細(xì)胞線粒體蛋白并組內(nèi)合并上清后蛋白定量，每管濃度1 mg 分裝，保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.3 固相PH梯度-SDS雙向凝膠電泳及圖譜分析

取待測樣品加水化液至 350μl后進(jìn)行一項(xiàng)等電聚焦，結(jié)束后進(jìn)行 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。考馬斯亮藍(lán)G-250染色過夜并清洗。用清華紫光D3000圖像掃描儀掃描凝膠。軟件 Bio-rad PDquest分析差異蛋白并取差異10倍以上點(diǎn)做質(zhì)譜檢測。

1.4 MS（質(zhì)譜）鑒定

用取點(diǎn)器將候選蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，去離子水反復(fù)沖洗10 min，置于EP管中，移液槍吸盡水分。由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行酶解后 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜檢測肽質(zhì)量指紋譜和通過 Mascot查詢 NCBInr數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。查詢參數(shù)：物種來源小鼠；胰蛋白酶水解；酶解片段不完全選擇為1；肽片段相對分子質(zhì)量最大允許誤差控制在±0.1Da。

2 結(jié)果

2.1 2 -DE圖譜分析結(jié)果

每組進(jìn)行 3次電泳。分析掃描圖，兩組間并無缺失和新增蛋白點(diǎn)，差異蛋白點(diǎn)共 233個(gè)，5倍以上有 25個(gè)，10倍以上有6個(gè)。上調(diào)5倍以上的蛋白點(diǎn)有19個(gè)；下調(diào)5倍以上的點(diǎn)有6個(gè)。差異蛋白10倍以上點(diǎn)有5個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)（見表1）。

表1 游泳訓(xùn)練后小鼠肝線粒體差異10倍以上的蛋白點(diǎn)

2.2 MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果

差異表達(dá)10倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，結(jié)果通過Mascot查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫，鑒定出三個(gè)在線粒體表達(dá)上調(diào)的蛋白：熱休克蛋白60

（HSP60）、乙醛脫氫酶（ALDH）和細(xì)胞色素b-C1復(fù)合物亞基1（QCR1）（見表2）。1903號點(diǎn)的127號肽段其氨基酸序列為HSP60的特定序列269-290（R.KPLVIIAEDVDGEALSTLVLNR.L），其得分165；4704號點(diǎn)的152號肽段其氨基酸序列為ALDH2的特定序列229-259（K.EAGFPPGVVNIVPGFGPTAGAAIASHEGVDK.V），其得分121；2602號點(diǎn)的126號肽段其氨基酸序列為QCR1的特定序列397-415（R.NALVSHLDGTTPVCEDIGR.S），其得分151（見圖2）。

表2 MS（質(zhì)譜）鑒定結(jié)果

圖2 蛋白點(diǎn)質(zhì)譜圖

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，其合成的 ATP能為細(xì)胞生命活動(dòng)提供直接能量，在各種生理病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。已有研究報(bào)道，適宜運(yùn)動(dòng)可減少線粒體能量損耗及氧化損傷，保護(hù)肝臟[4]。8周的訓(xùn)練可減輕情緒應(yīng)激大鼠肝線粒體氧化應(yīng)激[5]。然而，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練機(jī)體肝線粒體差異蛋白質(zhì)組表達(dá)和分析少有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)顯示，差異表達(dá)10倍以上的蛋白點(diǎn)將在線粒體中發(fā)揮重要作用，繼而顯著影響到所在組織器官細(xì)胞的功能。質(zhì)譜鑒定出上調(diào) 10倍以上的肝線粒體蛋白有HSP60、ALDH2和 QCR1，顯然游泳訓(xùn)練使機(jī)體肝細(xì)胞將受到這三種蛋白特殊生物學(xué)作用的突出影響。

熱休克蛋白（HSP）為應(yīng)激蛋白，是結(jié)構(gòu)上高保守的多肽，生物細(xì)胞受高溫、病原體或其他損傷因素的應(yīng)激刺激后發(fā)生熱休克反應(yīng)所產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。本身不直接發(fā)揮作用，而通過改變或修飾其他蛋白并影響或調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能，間接發(fā)揮作用 。其中，HSP60為14個(gè)亞單位組成的寡聚體,主要存于線粒體中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與線粒體之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中十分重要[6]。本研究三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練后 HSP60表達(dá)上調(diào)，顯然肝線粒體發(fā)生了運(yùn)動(dòng)適應(yīng)和提高了應(yīng)激能力,對肝細(xì)胞抗損害和維持正常功能有利，說明三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練可能通過保護(hù)線粒體繼而發(fā)揮保護(hù)肝臟作用。

乙醛脫氫酶(ALDH)是醛類氧化酶，是酒精在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶。ALDH2是一種由染色體 12q24 編碼的四聯(lián)體蛋白，其在核中編碼后由 17-氨基酸 N-末端線粒體定位序列共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)。已有研究報(bào)道證實(shí)心臟保護(hù)過程中 ALDH2起到重要作用[7]。本研究中顯示，ALDH2表達(dá)增加,顯然游泳訓(xùn)練后其在線粒體的相關(guān)生物學(xué)功用加強(qiáng)，肝線粒體及細(xì)胞將受到保護(hù)。

細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體是一個(gè)多亞基的膜蛋白復(fù)合體，分布于線粒體膜、線粒體電子傳遞鏈和細(xì)胞膜。在線粒體呼吸電子傳遞鏈其處于中點(diǎn)。既往運(yùn)動(dòng)機(jī)體具體到肝細(xì)胞線粒體QCR1表達(dá)變化不詳，本實(shí)驗(yàn)顯示三周游泳訓(xùn)練小鼠肝線粒體中其表達(dá)增加，線粒體呼吸鏈電子傳遞過程將加強(qiáng),勢必利于肝臟及機(jī)體能量供應(yīng)，起到提高肝細(xì)胞和身體功能水平作用。

4 結(jié)論

三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練小鼠與控制對照組肝線粒體差異表達(dá)蛋白點(diǎn)233個(gè)，5倍以上的差異點(diǎn)25個(gè)，10倍以上差異蛋白點(diǎn)6個(gè)，質(zhì)譜鑒定出上調(diào)10倍以上的三種肝線粒體蛋白為HSP60、ALDH2和QCR1，揭示三周輕負(fù)重游泳訓(xùn)練重點(diǎn)改善了線粒體保護(hù)機(jī)制和加強(qiáng)了能量代謝電子傳遞過程。提示，適宜運(yùn)動(dòng)對肝臟有益的機(jī)制與肝線粒體蛋白質(zhì)組差異表達(dá)有關(guān)，且HSP60、ALDH2和QCR1突出地發(fā)揮了生物學(xué)作用。

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Effects of Swimming Training for 3 Weeks on the Liver Mitochondrial Proteome of Mice

LIU Lu, et al.
（PE College of Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan, China）

[Objective]The technologies of two dimensional gel electrophoresis and mass spectrum were used to study the effects on liver mitochondria proteome of mice with three week swimming training. [Methods] Totally 20 ICR male mouse divided into control group(C) and swimming training group(TB). The TB group by light weight after 48 hours and C group were killed and the total protein of liver was determined by two dimensional gel electrophoresis separation and analyzing image and collecting data. Mass spectrum was more than 10 times Protein Spots in the two groups. [Results] There are 25 increased expression more than 5 times and 6 decreased expression.5 increased and 1 decreased more than 10 times. Protein spots of differential expression more than 10 times were selected as object protein in MS identification and three indicating proteins were identified as HSP60, ALDH and QCR1. [Conclusions] Expression of Liver mitochondria proteins in mice were differential after three week of swimming training，and increase the expression which may be the key that appropriate exercise is beneficial to the liver.

swimming; liver mitochondria; protein proteomics; mice; animal experiment

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（11JJ3111），湖南師范大學(xué)"運(yùn)動(dòng)促進(jìn)人口健康協(xié)同創(chuàng)新中心"課題（13ycrjxcz004）。

劉璐（1989-），山西臨汾人，研究生，研究方向：體育保健養(yǎng)生。