沈　亮, 徐　榮, 劉　賽, 徐常青, 賀　寧,2, 劉同寧, 陳　君,*

1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193

2 河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，焦作　454003

3 寧夏永寧縣本草蓯蓉種植基地，銀川　750100

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肉蓯蓉寄主梭梭根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)特征

沈亮1, 徐榮1, 劉賽1, 徐常青1, 賀寧1,2, 劉同寧3, 陳君1,*

1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

2 河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，焦作454003

3 寧夏永寧縣本草蓯蓉種植基地，銀川750100

為探索梭梭根際土壤微生物結(jié)構(gòu)特征及其與肉蓯蓉寄生的關(guān)系，應(yīng)用磷脂脂肪酸(PLFA)法分析了5—8月份梭梭生長(zhǎng)季節(jié)的根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)特征，采用濕篩傾注-蔗糖離心法對(duì)其根際土壤AM真菌進(jìn)行了初步分離和鑒定，并分析了肉蓯蓉寄生與梭梭根際微生物及環(huán)境因子間的相關(guān)性。結(jié)果表明，5—7月3個(gè)月份的梭梭根際土壤微生物磷脂脂肪酸種類及含量均顯著高于8月份，總磷脂脂肪酸和AM真菌磷脂脂肪酸以6月份含量最高。梭梭根際土壤共鑒定出AM真菌4屬35種，它們分別為球囊霉屬(Glomus)22種、無(wú)梗囊霉屬(Acaulospora)7種、多孢囊霉屬(Diversispora)3種和巨孢囊霉屬(Gigaspora)3種。其中以黑球囊霉(Glomusmelanosporum)和雙網(wǎng)無(wú)梗囊霉(Acaulosporabireticulata)為優(yōu)勢(shì)種群，并且發(fā)現(xiàn)了與寄生有關(guān)的巨孢囊霉屬AM真菌。6月份和8月份的AM真菌孢子數(shù)量最多，而5月份的AM真菌孢子數(shù)量最低。6月份梭梭根際土壤提取液得到的肉蓯蓉種子萌發(fā)率(65.94%)和田間接種寄生率(59.19%)均為最高值，而5月份土壤提取液測(cè)試得到的肉蓯蓉種子萌發(fā)率最低。因此，推測(cè)梭梭根際AM真菌可能參與了肉蓯蓉的寄生過(guò)程。相關(guān)分析表明梭梭根際土壤微生物種類和數(shù)量主要與土壤溫濕度和土壤理化性質(zhì)相關(guān)性較大，其中可能與寄生有關(guān)的真菌數(shù)量與土壤溫度呈顯著正相關(guān)；肉蓯蓉寄生率與土壤溫度及土壤養(yǎng)分呈顯著負(fù)相關(guān)。研究為解析梭梭根際土壤微生物在肉蓯蓉寄生過(guò)程中的作用以及指導(dǎo)肉蓯蓉人工種植提供參考。

梭梭；肉蓯蓉；土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；磷脂脂肪酸；濕篩傾注-蔗糖離心法；環(huán)境因子

肉蓯蓉為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，專性寄生于莧科藜亞科梭梭屬植物梭梭Haloxylonammodendron(C. A. Mey.) Bunge根部[1]。肉蓯蓉為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便等功效[2]，有“沙漠人參”之美譽(yù)。隨著人們醫(yī)療保健意識(shí)的增強(qiáng)，補(bǔ)益類中藥需求量猛增，其野生資源蘊(yùn)藏量已不能滿足市場(chǎng)需求。國(guó)家明令禁止采挖野生肉蓯蓉，鼓勵(lì)通過(guò)人工種植滿足市場(chǎng)需求[1]。肉蓯蓉種子在沒(méi)有梭梭根系分泌物的作用下，難以萌發(fā)及完成寄生生活史[3]；目前尚未鑒定出梭梭根系產(chǎn)生的刺激肉蓯蓉種子萌發(fā)的關(guān)鍵物質(zhì)[4-5]。由于肉蓯蓉和梭梭的寄生機(jī)理不清，導(dǎo)致人工種植肉蓯蓉的寄生率不高，產(chǎn)量不穩(wěn)定。近年來(lái)，有研究表明寄主植物根系分泌物除了刺激寄生植物種子萌發(fā)外，還會(huì)促使寄主植物根際土壤微生物繁殖。根際微生物不僅在根系分泌物化學(xué)成分轉(zhuǎn)化和分解方面發(fā)揮作用；而且在植物根際快速繁殖的AM真菌還增大了寄主與土壤的接觸面積，進(jìn)而促進(jìn)寄主對(duì)養(yǎng)分的吸收和根系分泌物的釋放[6-7]，最終促使寄生植物寄生率的提高。此外，環(huán)境因子中的土壤養(yǎng)分、水分、溫度和濕度等因子也可引起根際土壤微生物種類及結(jié)構(gòu)的變化[8]。梭梭根際土壤微生物是否參與了肉蓯蓉的寄生過(guò)程以及不同季節(jié)梭梭根際土壤微生物的變化是否對(duì)肉蓯蓉的寄生產(chǎn)生影響，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究通常采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，但該方法成本高、工作量大，能夠培養(yǎng)分離的微生物只占總數(shù)的0.1%—10%，不能夠全面反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的信息?，F(xiàn)代研究土壤微生物的方法主要有磷脂脂肪酸法(PLFA)、BIOLOG法、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)等[9-10]。其中PLFA是近幾年發(fā)展起來(lái)的研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的新方法，它能夠分析微生物群落的生物量和群落結(jié)構(gòu)變化，主要用于揭示植物栽培及季節(jié)變化等諸多因素對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響[11]。Ramsey等[12]研究表明PLFA也能夠表征Biolog和DGGE方法檢測(cè)出的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，在土壤微生物檢測(cè)領(lǐng)域具有一定優(yōu)勢(shì)。因此，本研究擬采用PLFA法及常規(guī)AM真菌鑒定法[13]，對(duì)梭梭5—8月份生長(zhǎng)季節(jié)的根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，結(jié)合環(huán)境因子探討梭梭根際土壤微生物在肉蓯蓉寄生過(guò)程中的作用，研究結(jié)果將為解析肉蓯蓉寄生機(jī)理及指導(dǎo)肉蓯蓉人工種植提供參考。

1　材料與方法

1.1梭梭根際土及對(duì)照土樣采集與處理

試驗(yàn)設(shè)在寧夏回族自治區(qū)永寧縣本草蓯蓉種植基地，該基地地理坐標(biāo)為東經(jīng)106°40′、北緯38°15′，海拔1125 m。肉蓯蓉種子來(lái)自內(nèi)蒙古阿拉善盟右旗野生肉蓯蓉植株。4年生寄主梭梭來(lái)自寧夏肉蓯蓉種植基地，梭梭高1—2 m，行距3 m，株距1 m。

5—8月份梭梭快速生長(zhǎng)期，在種植基地選擇一塊長(zhǎng)勢(shì)一致、土壤質(zhì)地均一、近2年內(nèi)未受干擾的梭梭種植田，面積為20 m×20 m。調(diào)查期間該樣地杜絕人為干擾，每月初在試驗(yàn)田按照“S”形取樣法，收集15株40—50 cm深處的梭梭根際土。采用抖落法收集梭梭毛細(xì)根周圍0.5 cm內(nèi)粘連的根際土壤1.00 kg；供試土壤為沙壤土，除去樣品中植物殘?bào)w和碎石，過(guò)2 mm篩后分成2部分，一部分土樣冷凍干燥后保存在-80℃，用于PLFA分析；另一部分土樣風(fēng)干用于土壤基本理化性狀測(cè)定。對(duì)照樣品為5月份采集的試驗(yàn)地50 cm深處的非梭梭根際土1份。

1.2土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)分析

1.2.1PLFA分析

PLFA的提取過(guò)程參考Frostegrd等方法[14]。提取過(guò)程分成4個(gè)步驟：脂肪酸釋放與甲酯化、溶液中和、脂肪酸萃取、脂肪酸溶解。PLFAs成份測(cè)定參考Dong等方法[15]進(jìn)行，采用美國(guó)Agilent 6890氣相色譜儀、Agilent 5977質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5 MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)(安捷倫科技有限公司)等儀器進(jìn)行測(cè)試。

PLFA命名及含量計(jì)算：采取通用的ω命名系統(tǒng)，前綴a，i和cy分別表示反式，順式和環(huán)狀支鏈構(gòu)型。以18:2ω6,9為例，18表示主鏈C原子數(shù)目，冒號(hào)“:”后數(shù)字代表不飽和度，ω后數(shù)字代表雙鍵所在位置。表征細(xì)菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌的磷脂脂肪酸標(biāo)記參考Kimura等方法[16-18]。磷脂脂肪酸含量測(cè)定用峰面積法，計(jì)算公式為

PLFA(nmol/g)=(PPLFA×S×V)/(PSTD×D×R×W)

式中，PPLFA和PSTD分別是樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰值面積，S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度(ng/μL)，V為樣品測(cè)試體積(1 μL)，R為分取倍數(shù)(1/1000)，D為稀釋倍數(shù)(10倍)，W為干土質(zhì)量(g)。

1.2.2AM真菌分離與鑒定

采用濕篩傾注-蔗糖離心法[19]分離土壤孢子，在體視顯微鏡下觀察孢子大小、顏色、菌絲特征、孢子形態(tài)等指標(biāo)。根據(jù)《VA菌根真菌鑒定手冊(cè)》[20]進(jìn)行分類描述和種屬檢索和鑒定。不同月份AM真菌孢子數(shù)量采用計(jì)數(shù)法進(jìn)行。

1.3肉蓯蓉田間接種寄生及種子萌發(fā)試驗(yàn)

在距梭梭主根40 cm處挖深50 cm、寬20 cm接種坑，每坑接肉蓯蓉種子40—60粒，共接種30株梭梭。首次接種時(shí)間為5月14日，1個(gè)月后調(diào)查寄生率，每次調(diào)查后重新接種，即分別得到6月15日、7月15日和8月15日的接種寄生率：

肉蓯蓉寄生率(%)=寄生數(shù)/接種坑數(shù)×100%

取每月采集的土樣10 g添加50%的甲醇水溶液，超聲35 min，溫度為47℃，震蕩12 h，150r/min，離心，取提取液10 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，做成0.2 g/m的提取液，稀釋1000倍用于肉蓯蓉種子萌發(fā)試驗(yàn)[21]。

種子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)種子數(shù)/測(cè)試種子數(shù)×100%

1.4環(huán)境因子測(cè)定方法

1.4.1氣象數(shù)據(jù)收集

采自寧夏本草蓯蓉種植基地的AR5自動(dòng)氣象站，設(shè)定為1 h采集1次氣象因子數(shù)據(jù)，不同月份氣象數(shù)據(jù)為該月氣象數(shù)據(jù)的總平均值。采集的氣象因子有：氣溫(TA)、大氣相對(duì)濕度(RH)、光照有效輻射(PAR)、50 cm土壤濕度(SM50)、50 cm土壤溫度(ST50)，降雨量(PT)。

1.4.2土壤養(yǎng)分測(cè)定

土壤全氮(TN)采用凱氏定氮儀測(cè)定；有效磷(AP)采用鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀(AK)采用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)(OM)采用重鉻酸鉀-外加熱容重法測(cè)定；pH值采用pH 300型便攜式pH酸度計(jì)法測(cè)定。

1.5數(shù)據(jù)分析

結(jié)果為3次重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析、主成分分析，用單因素方差分析法(LSD法)檢驗(yàn)差異顯著性，利用主成分分析法(PCA)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)比較，結(jié)果為所測(cè)指標(biāo)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2　結(jié)果與分析

2.1不同月份梭梭土壤微生物磷脂脂肪酸含量比較

由表1得知，不同月份梭梭根際土壤微生物PLFA種類及含量差異顯著。5—8月份土壤微生物總磷脂脂肪酸的含量為6月>7月>5月>8月，說(shuō)明隨著月份變化，梭梭根際土壤微生物的總磷脂脂肪酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、放線菌以及需氧菌5—7月份的PLFA含量均高于8月份，且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中真菌的PLFA含量范圍為1.70—2.27 nmol/g，以7月份含量最高，8月份含量較低；AM真菌含量范圍為0.24—0.33 nmol/g，以6月份含量最高，8月份含量最低。此外，對(duì)照土CK土壤微生物的PLFA含量均顯著低于不同月份梭梭根際土壤微生物的PLFA值。因此，不同月份環(huán)境條件的改變能夠引起梭梭根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化。

表1　梭梭土壤微生物磷脂脂肪酸含量比較/(nmol/g)Table 1　Relative abundances of individual PLFAs in soil ofHaloxylonammodendron

2.2不同月份梭梭根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析

對(duì)不同月份梭梭根際土壤微生物的磷脂脂肪酸進(jìn)行主成分分析(圖1a)。結(jié)果表明，第一主成分對(duì)總PLFA數(shù)據(jù)變異的貢獻(xiàn)率是90.12%，第二主成分對(duì)總PLFA數(shù)據(jù)變異的貢獻(xiàn)率是9.21%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.33%。因此，兩個(gè)主成分可以全面反映研究區(qū)域微生物群落的情況。從圖1a可看出，CK及5—8月份的梭梭根際土壤微生物均與第一主成分高度正相關(guān)；大部分5月份、7月份及8月份的梭梭根際土壤微生物與第二主成分高度正相關(guān)，而大部分的6月份樣品與PC2呈負(fù)相關(guān)。除8月份梭梭根際土壤微生物外，5—7月份梭梭樣品相距較近。對(duì)照處理CK與6月份的樣品距離較近，說(shuō)明二者結(jié)構(gòu)較為相似?？傊?，環(huán)境因子對(duì)不同月份的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響極為明顯，5—7月份梭梭根際土壤微生物結(jié)構(gòu)相似，三者均與8月份樣品差異顯著。

通過(guò)各種土壤微生物在主成分上的載荷因子分析表明(圖1b)，代表細(xì)菌、厭氧菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和放線菌的磷脂脂肪酸在主成分一(65.75%)上的載荷值較高，主成分一是它們的代表因子，而代表真菌及需氧菌的磷脂脂肪酸在主成分一上均具有較低的載荷值。說(shuō)明梭梭根際土壤的細(xì)菌、厭氧菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和放線菌的數(shù)量較多，而真菌及需氧菌的數(shù)量相對(duì)較少。代表革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及AM真菌的磷脂脂肪酸在主成分二(25.43%)上有較高的載荷值，而代表真菌的磷脂脂肪酸在主成分二上的含量較低。說(shuō)明革蘭氏陰性細(xì)菌及AM真菌的數(shù)量較多，而真菌的含量較低。綜合分析得出，隨著月份上升，土壤中的細(xì)菌及放線菌類微生物數(shù)量不斷增多，而真菌類微生物數(shù)量較少。

圖1　梭梭根際土壤微生物群落PLFA主成分分析(a)；梭梭根際土壤微生物群落PLFA載荷因子貢獻(xiàn)(b)Fig.1　PCA of PLFA profiles from soil microbial communities of Haloxylon ammodendron (a); Eigenvector loading of PLFA contributing to soil microbial communities ordination pattern of Haloxylon ammodendron (b)

2.3不同月份梭梭根際AM真菌種類及數(shù)量分析

由圖2得知，梭梭根際土壤共分離鑒定出4屬35種AM真菌。其中球囊霉屬(Glomus)22種、無(wú)梗囊霉屬(Acaulospora)7種、多孢囊霉屬(Diversispora)3種、巨孢囊霉屬(Gigaspora)3種。黑球囊霉(G.melanosporum)和雙網(wǎng)無(wú)梗囊霉(A.bireticulata)為其中主要的優(yōu)勢(shì)菌種，且在各土壤樣品中均有分布。通過(guò)計(jì)數(shù)法分析得知5—8月份梭梭根際土壤AM真菌孢子數(shù)量隨氣溫升高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。5月份土壤樣品中孢子數(shù)量(17.5個(gè)/g)最低，6月份(31.0個(gè)/g)和8月份(35.5個(gè)/g)AM真菌孢子密度最高。

2.4肉蓯蓉寄生率及梭梭根際土壤微生物與環(huán)境因子相關(guān)分析

肉蓯蓉種子萌發(fā)及接種寄生試驗(yàn)表明不同月份的肉蓯蓉田間接種寄生率差異較大(表2)。與對(duì)照相比，測(cè)試6月份的梭梭根際土壤提取液得到的肉蓯蓉種子萌發(fā)率最高，而5月份的種子萌發(fā)率最低；6月份的肉蓯蓉田間接種寄生率最高，而8月份的肉蓯蓉田間接種寄生率最低。

本試驗(yàn)基地地處我國(guó)溫帶大陸性氣候區(qū)，不同月份的氣候因子差異較大，且隨著氣候因子的變化，梭梭根際土壤的基本養(yǎng)分也發(fā)生了顯著變化(表3,表4)。土壤養(yǎng)分及氣候因子均可以引起根際土壤微生物種類及結(jié)構(gòu)的變化。相關(guān)分析表明(表5)，厭氧菌與氣溫的相關(guān)性達(dá)到負(fù)顯著性水平(P<0.05)，需氧菌與50 cm深土壤濕度間的相關(guān)性達(dá)到正顯著性水平(P<0.05)，真菌與土壤溫度之間的相關(guān)性達(dá)到正顯著性水平(P<0.05)。由此說(shuō)明，梭梭根際土壤微生物種類及含量主要受溫度和濕度影響。梭梭根際微生物與土壤養(yǎng)分間的相關(guān)分析表明，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌與各土壤養(yǎng)分的相關(guān)性均達(dá)到負(fù)顯著性水平(P<0.05)，真菌與土壤全氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)性，其它微生物與土壤養(yǎng)分各指標(biāo)不相關(guān)。這說(shuō)明革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的數(shù)量隨著土壤養(yǎng)分的上升而上升，真菌隨著土壤養(yǎng)分的增加而上升。肉蓯蓉寄生率與環(huán)境因子的相關(guān)分析表明，肉蓯蓉種子萌發(fā)率及田間寄生率與50 cm深土壤溫度呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，與土壤全氮呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。這說(shuō)明隨著50 cm深土壤溫度的增大，肉蓯蓉的寄生率逐漸降低；隨著土壤養(yǎng)分的升高，肉蓯蓉的寄生率逐漸下降。

表2　肉蓯蓉種子萌發(fā)率及接種寄生率Table 2　Germination rate and parasitism rate ofCistanchedeserticola

表3　梭梭采樣點(diǎn)環(huán)境因子Table 3　The climate data of collection sites ofHaloxylonammodendron

表4　梭梭根際土壤養(yǎng)分基本理化指標(biāo)Table 4　Basic physical and chemical characteristics of rhizosphere soil ofHaloxylonammodendron

表5　環(huán)境因子與梭梭根際土壤微生物磷脂脂肪酸及肉蓯蓉寄生率的Person相關(guān)分析Table 5　Pearson′s correlation analysis among environment factor, parasitism rate ofCistanchedeserticolaand soil microbial PLFAs ofHaloxylonammodendron

3　討論

3.1梭梭根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)分析

土壤微生物主要包括土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌及藻類。本研究中除對(duì)照CK及8月份的樣品沒(méi)有檢測(cè)到厭氧菌外，其他不同月份的梭梭根際土壤中均檢測(cè)到了細(xì)菌、真菌、AM真菌及放線菌。其中以表征細(xì)菌的PLFA所占的比例最高，其次是真菌、放線菌占的比例最低，這與以往的研究結(jié)果相似[22]。一般來(lái)說(shuō)，土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為真菌，放線菌數(shù)量最少。隨著環(huán)境變化，土壤微生物區(qū)系種類也會(huì)發(fā)生顯著改變[23]。細(xì)菌含量較高因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖快、抗逆性強(qiáng)、可以生存于濕潤(rùn)及透氣性不好的環(huán)境[24]；真菌含量相對(duì)較少是因其只適宜于生長(zhǎng)在通氣良好的環(huán)境中；放線菌喜熱、耐旱，但其競(jìng)爭(zhēng)力較弱[25-26]，種群較小。梭梭根際土壤微生物的PLFA含量顯著高于對(duì)照土CK，說(shuō)明梭梭根系分泌物可以促進(jìn)其根際土壤微生物生長(zhǎng)。羅倩等[27]采用平板培養(yǎng)法研究了梭梭根際和非根際土壤微生物的數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明梭梭具有較強(qiáng)的根際正效應(yīng)，且根際微生物也顯著促進(jìn)梭梭的生長(zhǎng)及其對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收。通常植物光合產(chǎn)物有4%—7%通過(guò)分泌作用進(jìn)入土壤，在根系分泌物的作用下，根際微生物得到快速生長(zhǎng)，其種類及數(shù)量遠(yuǎn)高于非根際土壤微生物[28]。

3.2環(huán)境因子對(duì)梭梭根際土壤微生物的影響

研究表明梭梭在不同生長(zhǎng)時(shí)期，其根際土壤微生物的數(shù)量、種類及優(yōu)勢(shì)種等均存在一定差異，這與不同環(huán)境條件下的梭梭根系分泌物種類和含量有關(guān)[29]。梭梭一般為4月底抽出新芽，5月中旬開(kāi)花，6月初進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，7—8月發(fā)育中的種子進(jìn)入休眠期，9—10月種子進(jìn)入成熟期。研究表明5—7月份的梭梭根系微生物種類及含量高于8月份樣品。這與5—7月氣溫及濕度適宜，梭梭生長(zhǎng)活躍，大量產(chǎn)生根系分泌物促進(jìn)其根際土壤微生物的生長(zhǎng)有關(guān)；8月份天氣炎熱，梭梭生長(zhǎng)緩慢進(jìn)入夏季休眠階段導(dǎo)致其根系分泌物減少，使得其根際土壤微生物的活動(dòng)減弱。陳子英等[30]研究表明冬小麥由幼苗期到返青期間的根際微生物的數(shù)量最高，而返青后迅速減少，這與小麥返青期間產(chǎn)生的大量根系分泌物有關(guān)。

相關(guān)分析表明真菌與土壤溫度間的相關(guān)性達(dá)到正顯著性水平，說(shuō)明梭梭根際真菌的數(shù)量隨著溫度上升逐漸增大。5—7月份的梭梭根際細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物PLFA含量顯著高于8月份，可能與5—7月份采樣點(diǎn)降雨量、大氣相對(duì)濕度和土壤濕度等條件較好，使得土壤微生物快速生長(zhǎng)有關(guān)；土壤溫濕度較高也促使梭梭毛細(xì)根生長(zhǎng)較快，使其根系分泌物增加，進(jìn)而促進(jìn)了土壤微生物種類及數(shù)量的增加。肉蓯蓉寄生率與50 cm深土壤溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著土壤溫度升高，肉蓯蓉的寄生率逐漸降低。因此，結(jié)合真菌與土壤溫度的相關(guān)分析，得出肉蓯蓉的最適寄生溫度應(yīng)該在6月份。肉蓯蓉的寄生率與土壤養(yǎng)分顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在土壤養(yǎng)分含量較低的時(shí)候肉蓯蓉寄生率較高，這可能與土壤貧瘠引起其根際土壤微生物的大量繁殖，促進(jìn)了肉蓯蓉的寄生有關(guān)。該試驗(yàn)基地的平均pH值為9.12，較高的pH值與該基地位于偏堿性水質(zhì)的黃河附近有關(guān)，這與梭梭耐鹽堿的生長(zhǎng)特性也一致。大多數(shù)微生物適宜在中性或微堿性環(huán)境中生存，土壤pH值降低會(huì)減弱微生物的活動(dòng)并影響到其生長(zhǎng)狀況[31]，該基地6月份較高的pH值及適宜的氣候可能促進(jìn)梭梭根際土壤微生物大量繁殖，這對(duì)梭梭根系分泌物的釋放具有一定的促進(jìn)作用。

3.3梭梭根際土壤微生物變化對(duì)肉蓯蓉寄生的影響

近年來(lái)，肉蓯蓉與梭梭的寄生機(jī)理已成為肉蓯蓉研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。李天然等[3]研究表明肉蓯蓉種子只有在梭梭根系分泌物存在的情況下才能萌發(fā)，且只在多年生的梭梭根際才能完成寄生生活史。梭梭是多年生旱生小喬木，一些較為成熟的寄生性草本植物根系分泌物研究方法，如獨(dú)角金(Strigaasiatica)、百脈根(Lotusjaponicus)和菟絲子(Cuscutachinensis)等水溶液培養(yǎng)方法很難用于梭梭根系分泌物的研究，且多年生、沙生性的生物特征也使得梭梭很難在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展研究[7,32-33]；田間收集的梭梭根系分泌物因受土壤微生物、土壤小動(dòng)物及植物殘?bào)w等因素影響難以有效控制。因此，目前還未見(jiàn)有關(guān)從梭梭根系分泌物中得到刺激肉蓯蓉種子萌發(fā)的相關(guān)物質(zhì)報(bào)道。有研究表明植物根際土壤微生物可以通過(guò)改變寄主植物根際營(yíng)養(yǎng)狀況和植物激素含量來(lái)改變植物體內(nèi)生理生化過(guò)程，從而影響寄主根系分泌物種類和數(shù)量[34]。本研究首次對(duì)不同季節(jié)的梭梭根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明肉蓯蓉田間寄生率與其根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化有一定相關(guān)性，二者的最高值均出現(xiàn)在6月份。Akiyama等[7]研究表明，百脈根根系分泌物中含有促進(jìn)產(chǎn)生菌絲分支的化學(xué)物質(zhì)5-deoxystrigol，在很低的濃度時(shí)就可以刺激其根系周圍菌根真菌產(chǎn)生大量分支。因此，寄生植物在寄生過(guò)程中與其寄主根際土壤微生物的關(guān)系密切。有研究表明珠狀巨孢囊霉(G.margarita)通過(guò)在寄主百脈根毛細(xì)根處定植及產(chǎn)生分支，增大百脈根與土壤的接觸面積，從而促進(jìn)其對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收和寄生關(guān)鍵物質(zhì)的分泌，本研究也從梭梭根際土壤中發(fā)現(xiàn)了可能參與寄生的巨孢囊霉屬AM真菌[7]。因此，梭梭根際土壤微生物可能參與肉蓯蓉的寄生過(guò)程。

由于田間試驗(yàn)影響因素較多，梭梭根際微生物是否參與肉蓯蓉的寄生，還需要進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)梭梭的生長(zhǎng)特性及前人研究方法，已經(jīng)初步摸索出了一套嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶镩g梭梭根系分泌物和根際土壤微生物收集及分析方法，相關(guān)研究工作正在進(jìn)行中。由于磷脂不能作為細(xì)胞的貯存物質(zhì)，一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化合物就會(huì)迅速分解，使得PLFA的測(cè)試結(jié)果不能準(zhǔn)確的代表土壤微生物的真實(shí)信息。此外，該方法只能從土壤微生物屬的水平上進(jìn)行鑒定，不能到達(dá)種的水平。因此，后續(xù)用于梭梭根際特定微生物類群的分析還需要利用PCR-DGGE等方法進(jìn)行。

4　結(jié)論

(1)5—7月份梭梭根際土壤微生物種類及PLFA含量顯著高于8月份，以6月份總PLFA及AM真菌PLFA含量最高；采用濕篩傾注-蔗糖離心法，從梭梭根際土壤共鑒定出4屬35種AM真菌。它們分別為：球囊霉屬22種、無(wú)梗囊霉屬7種、多孢囊霉屬3種、巨孢囊霉屬3種。其中以黑球囊霉和雙網(wǎng)無(wú)梗囊霉為優(yōu)勢(shì)種群，以6月份和8月份的梭梭根際土壤AM真菌孢子數(shù)量最高，且發(fā)現(xiàn)了可能參與寄生的巨孢囊霉屬AM真菌。

(2)梭梭根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化受氣候因子及土壤養(yǎng)分的顯著影響；與寄生有關(guān)的真菌數(shù)量與50 cm深土壤溫度呈顯著正相關(guān)；肉蓯蓉寄生率與50 cm深土壤溫度及土壤養(yǎng)分呈顯著負(fù)相關(guān)。

(3)6月份梭梭根際土壤提取液得到的肉蓯蓉種子萌發(fā)率和肉蓯蓉田間接種寄生率在5—8月份中均最高，這與6月份梭梭根際土壤微生物的種類及PLFA含量較高顯著相關(guān)。根據(jù)以上結(jié)果，本研究推測(cè)梭梭根際土壤微生物可能參與了肉蓯蓉的寄生過(guò)程。

致謝：孔垂華教授、董紅云博士、夏志超博士、劉源經(jīng)理及常玉成農(nóng)藝師在實(shí)驗(yàn)材料收集、樣品測(cè)試及分析工作中給予幫助，特此致謝。

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Characteristics of microbial community structure in rhizosphere soil ofHaloxylonammodendron

SHEN Liang1, XU Rong1, LIU Sai1, XU Changqing1, HE Ning1,2, LIU Tongning3, CHEN Jun1,*

1InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China

2InstituteofResourceandEnvironment,HenanPolytechnicUniversity,Jiaozuo454003,China

3NingxiaYongningPlantationofHerbaCistanche,Yinchuan750100,China

The aim of this study was to analyze the effects of the microbial community structure in the rhizosphere soil ofHaloxylonammodendronon parasitism byCistanchedeserticola. The microbial community structure and arbuscular mycorrhizae (AM) fungal species were determined in samples collected from May 2013 to August 2013 by chloroform fumigation-extraction, phospholipid fatty acid (PLFA) analysis, and wet sieving and centrifugation methods. These findings were then used to reveal the relationships between parasitism byC.deserticola, the microbial community ofH.ammodendronand environmental factors. The results showed that species diversity and the overall quantity of microbial cells were significantly more abundant than in August, and that the PLFA content and total number of AM fungi were higher in samples collected in June. The PLFA concentration data were subjected to principal component analysis (PCA), and the first two principal components (PC1, PC2) accounted for 90.12% and 9.21% of the total variation, respectively. This confirmed that the soil microbial community ofH.ammodendronchanged significantly during growth between May and August. Specifically identified PLFAs, including fatty acids that represented bacteria and fungi, were distributed on the right side of the load diagram, while fatty acids that represented actinomycetes were distributed on the left side of the load diagram. Thus, these results indicate that duringH.ammodendrongrowth, total PLFA, PLFA representing bacteria and fungi, and PLFA representing actinomycetes all decreased from May to August. Thirty-five species of AM fungi from four genera were identified using the wet-sieving and centrifugation method. These included 22 species ofGlomus, seven species ofAcaulospora, three species ofDiversispora, and three species ofGigaspora. The dominant species wereGlomusmelanosporumandAcaulosporabireticulata. The number of AM fungal spores, calculated using the counting method, was highest in June and lowest in May. TheGigasporagenus, which may participate in the parasitic process ofC.deserticola, was found in the rhizosphere ofH.ammodendron. We also found that the seed germination rate (65.94%) and parasitic rate (59.19%) ofC.deserticolawere significantly higher in June than in the other months, by seed germination and field parasitic experiments, respectively. Correlation analysis showed that the variations in the soil microbial community ofH.ammodendronwere mainly influenced by soil moisture and temperature characteristics. The quantity of fungi, which may affect the parasitic process, was significantly positively correlated with the soil temperature, indicating that duringH.ammodendrongrowth and conditions of temperature increase, the PLFAs representing fungi increased. Furthermore, the germination rate and parasitism rate ofC.deserticolawere significantly negatively correlated with the 50 cm soil temperature and soil nutrients, indicating that during conditions of increased soil temperature and nutrient elements, the parasitism rate ofC.deserticolaincreased. In conclusion, we speculate that there is a strong correlation between soil microorganisms in theH.ammodendronrhizosphere and the parasitic rate ofC.deserticola. These findings provide deeper insight into the parasitic relationship betweenC.deserticolaandH.ammodendron.

Haloxylonammodendron;Cistanchedeserticola; soil microbial community structure; phospholipid fatty acid (PLFA); wet-sieving and centrifugation method; environmental factors

10.5846/stxb201410212063

中央級(jí)公益性科研院所項(xiàng)目課題(YZ2012-09)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81102748)；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1403324)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI05B03)

2014-10-21; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: junzichen@263.net

沈亮, 徐榮, 劉賽, 徐常青, 賀寧, 劉同寧, 陳君.肉蓯蓉寄主梭梭根際土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)特征.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(13):3933-3942.

Shen L, Xu R, Liu S, Xu C Q, He N, Liu T N, Chen J.Characteristics of microbial community structure in rhizosphere soil ofHaloxylonammodendron.Acta Ecologica Sinica,2016,36(13):3933-3942.