楊　龍　韓　冬（河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001）

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黃芪甲苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響*

楊龍△韓冬
（河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001）

目的 觀(guān)察黃芪甲苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響并探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用線(xiàn)栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、黃芪甲苷?。?0 mg/kg）、中（20 mg/ kg）、大劑量組（40 mg/kg）和銀杏葉提取物組（200 mg/kg），各20只，另取20只同齡大鼠作為假手術(shù)組；各治療組于再灌注30 min前腹腔注射給藥。再灌注24 h后，行神經(jīng)功能評(píng)分，測(cè)定腦組織含水量和腦梗死體積；檢測(cè)腦組織中抗氧化酶［過(guò)氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）］活性和丙二醛（MDA）含量，測(cè)定血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）含量，蘇木精-尹紅（HE）染色法觀(guān)察腦組織形態(tài)學(xué)變化；末端標(biāo)記（TUNEL）法觀(guān)察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況并計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），Western blotting法測(cè)定NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，含水量和腦梗死體積顯著降低；腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，血清中CK、LDH含量顯著降低；黃芪甲苷各治療組大鼠腦組織病變和神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況明顯好轉(zhuǎn)，均以大劑量組效果最為顯著，黃芪甲苷中、大劑量組AI顯著降低，腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 黃芪甲苷具有抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用，作用機(jī)制可能與黃芪甲苷能夠有效改善抗氧化酶活性、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

黃芪甲苷缺血再灌注氧化應(yīng)激

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Astragalosides on oxidative stress in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred rat models with focal cerebral ischemic reperfusion made by suture method were randomly divided into five groups：the model control group，Astragalosides（10，20，40 mg/kg）treated groups and Ginkgo biloba extract（200 mg/kg）treated group，and another 20 same-aged rats were selected as the sham group.30 min before operation，the drugs were given by intraperitoneal injection.Twenty-four hours after reperfusion，the neurological deficits，ratio of infarct volume，water content of the brain were evaluated；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in brain tissue were determined；the content of CK，LDH in serum were determined；the histopathological changes and neurocyte apoptosis were observed，and the AI were determined；the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and Semi-quantitative analysized.Results：Compared with the model control group，the neurological scores of Astragalosides（20，40 mg/kg）treated groups were significantly decreased，and the ratio of infarct volume and brain water content were significantly decreased；the activity of SOD，GSH-Px，CAT in brain tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased，and the content of CK，LDH in serum were significantly decreased；the histopathological changes and neurocyte apoptosis of Astragalosides treated groups were significantly improved，and the AI of Astragalosides（20，40 mg/kg）treated groups were significantly decreased；the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated；all of the difference above were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Astragalosides has inhibitive effects on the oxidative stress in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury，which is perhaps related to its pharmacological effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes，regulatingthe expression of NF-κB protein and depressing neurocyte apoptosis.

【Key words】Astragalosides；Ischemic-reperfusion；Oxidative stress

缺血再灌注并發(fā)癥是影響急性腦梗患者溶栓或介入手術(shù)治療愈后的重要因素，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中再灌注后隨著氧的大量涌入而引發(fā)的廣泛氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是缺血再灌注損傷最重要的病理生理基礎(chǔ)之一［1］，這也為我們研發(fā)能夠緩解缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、降血脂等多種藥理學(xué)活性［2-3］。近年來(lái)，李鐵成等［4］和馬小亮等［5］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠通過(guò)改善抗氧化酶活性、提高氧自由基清除能力而表現(xiàn)出對(duì)肝組織缺血再灌注損傷大鼠和心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，但黃芪甲苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷是否具有抑制作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將采用線(xiàn)栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，研究黃芪甲苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激的影響并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑黃芪甲苷（成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：150308，純度≥98%）；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；過(guò)氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒，HE、TUNEL試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物工程有限公司；核因子κB（NF-κB）單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠（7周齡，260～300 g），購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。動(dòng)物合格證號(hào)：1505009。

1.3主要儀器BS380型生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；UV-1800型紫外分光光度計(jì) （日本島津公司）；RMI255石蠟切片機(jī) （德國(guó)Leica公司）；RT-PCR儀 （武漢新未來(lái)儀器技術(shù)有限公司）；DYY-11型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽（北京六一儀器廠(chǎng)）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4造模與分組參照Longa EZ等報(bào)道的方法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型：腹腔注射水合氯醛實(shí)施麻醉后仰位固定，維持肛溫（38.0±0.5）℃，沿頸正中切口、暴露頸總動(dòng)脈（CCA）及頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）［6］。夾閉CCA和ICA并結(jié)扎ECA，在ECA殘端開(kāi)一小口，插入浸過(guò)肝素的拴線(xiàn)至大腦前動(dòng)脈止，同時(shí)松開(kāi)夾閉CCA和ICA的動(dòng)脈夾。拴線(xiàn)插入后在ECA插口近端用線(xiàn)結(jié)扎，逐層縫合；2 h后，將拴線(xiàn)輕輕拔出，恢復(fù)血流再灌注。取100只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、黃芪甲苷小劑量組（10 mg/kg）、黃芪甲苷中劑量組（20 mg/kg）、黃芪甲苷大劑量組（40 mg/kg）和銀杏葉提取物（200 mg/kg）組，每組20只。另取20只同齡大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組行手術(shù)通路，除不插入栓線(xiàn)外，其余操作同手術(shù)組。各治療組均于再灌注前30 min通過(guò)腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5觀(guān)察方法1）神經(jīng)功能評(píng)分。參照Bederson等報(bào)道的方法進(jìn)行盲法評(píng)分：置地上，向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分；提鼠尾，對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋，分別計(jì)1、2、3分；對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降，根據(jù)下降程度計(jì)1～3分；置金屬網(wǎng)上，根據(jù)對(duì)側(cè)肌張力下降程度計(jì)1～3分［7］。2）腦組織含水量的測(cè)定。腹腔注射烏拉坦實(shí)施麻醉后斷頭取腦并剝?nèi)∧X組織，去除嗅球、小腦和低位腦干后稱(chēng)質(zhì)量，為濕質(zhì)量（W）；置于110℃恒溫干燥箱中烘烤48 h后稱(chēng)質(zhì)量，為干質(zhì)量（D），計(jì)算腦組織含水量：腦含水量（%）=［（W-D）/W］×100%。3）腦梗死體積的測(cè)定。沿冠狀做5個(gè)切片，置于2%TTC染色液中，于37℃環(huán)境中恒溫避光孵育30 min，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織、蒼白色為梗死區(qū)，然后通過(guò)圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0分析梗死體積百分比。4）腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的檢測(cè)。剪碎后加入適量冷裂解液行研磨勻漿，3000 r/min離心10min后取上清液，然后通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)平行測(cè)定各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。5）血清中CK、LDH含量的檢測(cè)。斷頭取腦前，開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，1500 r/min離心10 min后取血清，然后通過(guò)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定血清中CK、LDH含量。6）腦組織形態(tài)學(xué)改變的觀(guān)察。大腦組織置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行組織固定，經(jīng)石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）和展片處理后，行常規(guī)HE染色，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察腦組織形態(tài)學(xué)變化并照相保存。7）細(xì)胞凋亡狀況的觀(guān)察及凋亡指數(shù)（AI）的計(jì)算。取腦組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后，按照試劑盒操作步驟行TUNEL染色（細(xì)胞核黃褐色為陽(yáng)性著色），然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況。AI的計(jì)算：每張染色切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，各組分別取平均值，然后計(jì)算各組大鼠凋亡指數(shù)：AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。8）細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)。制備腦組織勻漿液，經(jīng)12000 r/min低溫（4℃）離心10 min后取上清液，經(jīng)BCA法蛋白定量后，行變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗（NF-κB，β-actin）4℃過(guò)夜、洗膜、二抗室溫孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示；組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有極顯著性。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和腦梗死體積比較見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分較顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量和腦梗死體積均顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷大、中劑量組、銀杏葉提取物組大鼠腦組織含水量和腦梗死體積均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表1　各組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

表1　各組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　腦含水量（%）假手術(shù)組　20　77.8±1.4模型組　20　85.8±1.9**黃芪甲苷小劑量組　20　84.3±2.2神經(jīng)功能評(píng)分（分）　腦梗死體積（%）0.0±0.0　0.0±0.0 8.5±0.9**　28.4±2.3**7.8±1.2　25.1±2.9黃芪甲苷中劑量組　20　79.9±1.7△△6.3±0.6△△　21.7±2.6△黃芪甲苷大劑量組　20　4.8±0.5△△　17.4±2.0△△　78.1±1.8△△銀杏葉提取物組　20　6.5±0.7△△　22.4±2.8△　81.3±1.8△

2.2各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

表2　各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較（±s）

組別　n假手術(shù)組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）16.2±3.7　17.5±3.8 7.9±2.2**　9.4±2.1**8.6±2.9　10.1±2.3黃芪甲苷中劑量組　20　10.3±2.7△　11.3±2.8△黃芪甲苷大劑量組　20　12.5±3.4△△　13.6±3.5△△銀杏葉提取物組　20　9.7±2.5△　11.7±2.6△CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）4.9±1.3　4.6±1.2 2.5±0.6**　9.3±1.7**2.8±0.9　8.1±2.3 3.6±1.2△　6.5±1.8△△4.3±1.5△△　5.2±1.6△△3.0±0.8　6.1±1.4△△

2.3各組大鼠血清中CK、LDH含量比較見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組CK、LDH含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3　各組大鼠血清中CK、LDH含量比較（U/L，±s）

表3　各組大鼠血清中CK、LDH含量比較（U/L，±s）

組別　n假手術(shù)組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 CK　LDH 161.5±13.7　178.4±15.1 346.8±24.1**　360.5±27.3**310.4±26.9　341.9±32.7黃芪甲苷中劑量組　20　257.0±23.5△△　268.1±28.4△黃芪甲苷大劑量組　20　221.8±19.3△△　227.5±23.0△△銀杏葉提取物組　20　273.2±21.9△　263.8±25.1△

2.4各組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1。經(jīng)HE染色后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組大鼠腦組織呈現(xiàn)明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化，神經(jīng)細(xì)胞水腫變性、呈空泡狀，胞漿疏松、胞質(zhì)染色不均，胞核深染，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少等；而與模型組比較，黃芪甲苷各治療組大鼠缺血區(qū)域腦組織病變出現(xiàn)不同程度的改善，其中以黃芪甲苷大劑量組效果最為顯著。

圖1　各組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)（HE染色，200倍）

2.5各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況及AI經(jīng)TUNEL染色后通過(guò)顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組顯著增多，經(jīng)黃芪甲苷治療后局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況明顯較輕，其中以黃芪甲苷大劑量組效果最為顯著，見(jiàn)圖2。計(jì)算AI發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表4。

2.6各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)狀況見(jiàn)圖3，表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷中、大劑量組、銀杏葉提取物組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2　各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL染色，200倍）

表4　各組大鼠神經(jīng)元AI、腦組織NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

表4　各組大鼠神經(jīng)元AI、腦組織NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

組別　n假手術(shù)組　20模型組　20黃芪甲苷小劑量組　20 AI（%）　NF-κB/β-actin 3.4±1.2　0.13±0.05 41.5±6.3**　0.42±0.13**36.2±5.7　0.37±0.12黃芪甲苷中劑量組　20　28.0±5.1△　0.34±0.08△黃芪甲苷大劑量組　20　19.3±4.2△△　0.21±0.07△△銀杏葉提取物組　20　30.8±4.7△　0.28±0.11△

圖3　各組細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)

3　討　論

正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自由基（ROS）能夠在SOD的催化作用下還原生成H2O2，并在GSH-Px 或CAT催化作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人無(wú)害的H2O 和O2［8-9］，從而維持體內(nèi)氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡，因此SOD、GSH-Px、CAT共同構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，它們的活性能夠直接反映機(jī)體抗氧化能力；而血清中脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映細(xì)胞損傷程度。神經(jīng)細(xì)胞膜受氧自由基攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷后，細(xì)胞內(nèi)CK和LDH將迅速釋放入血，致使血清中二者含量陡然增高，能夠敏感而準(zhǔn)確地反映神經(jīng)細(xì)胞受氧自由基損傷程度。

細(xì)胞凋亡是一種繼發(fā)行為，氧化應(yīng)激損傷是其非常重要的誘發(fā)因素之一［10］，NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，被稱(chēng)為連接氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的“橋梁”［11］。Zhang Q等研究發(fā)現(xiàn)，受ROS攻擊而活化的NF-κB能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］；并且被活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后能夠與DNA的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，參與調(diào)控下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［13］，證實(shí)NF-κB激活與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線(xiàn)栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)黃芪甲苷（20、40 mg/kg）治療能夠顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能癥狀、顯著降低腦梗死體積和腦組織含水量、明顯改善腦組織病變；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，黃芪甲苷（20、40 mg/kg）治療治療組腦組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性顯著升高、MDA含量顯著降低、血清中CK和LDH含量顯著降低，腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況顯著改善；提示黃芪甲苷具有降低局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用，其作用機(jī)制可能與黃芪甲苷能夠有效改善抗氧化酶活性、提高機(jī)體清除自由基能力以及下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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（收入日期2015-12-28）

The Effects of Astragalosides on Oxidative Stress in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

YANG Long，HAN Dong.Cangzhou Central Hospital，Hebei，Cangzhou 061001，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0799-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.014

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃項(xiàng)目（20130359）
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