闞亮 張萌 何平

近年來肺癌發(fā)病率持續(xù)升高，已躍然成為惡性腫瘤死因的第一位[1-3]。盡管對于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、鼠肉瘤病毒（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,K-RAS）和間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase,ALK）等基因突變的病例可選用靶向藥物進行治療，然而這些基因的突變僅存在于肺腺癌當中的部分病例中。另一方面，各種遺傳、表觀和微環(huán)境因素的相互復(fù)雜作用也顯著影響腫瘤細胞的生存和侵襲[4,5]。因此，揭示肺癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，發(fā)現(xiàn)肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子或靶點，對于開發(fā)治療肺癌的新的靶向藥物具有重要的理論和臨床意義。

富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine rich repeat-containing,LRR-containing）蛋白是具有保守亮氨酸序列的跨膜蛋白。該蛋白參與許多重要的生命進程，包括動植物免疫、細胞粘附、激素受體作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達調(diào)控以及凋亡等過程[6,7]。幾項人類癌癥微陣列的研究顯示LRRC3B在乳腺癌和結(jié)腸直腸癌表達下調(diào)，表明LRRC3B參與致癌作用[8]。據(jù)報道，LRRC3B mRNA在胃癌組織中表達下調(diào)，在裸鼠胃癌細胞中引入LRRC3B則會抑制集落的形成以及腫瘤的發(fā)生[9]。但是目前還沒有報導(dǎo)人類非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中LRRC3B相關(guān)蛋白的表達模式以及臨床作用。其在肺癌細胞中的生物學功能也仍然是未知的。我們猜想它可能在肺癌細胞中也是低表達，并抑制一些細胞功能的發(fā)揮。我們通過Western blot和Realtime RT-PCR檢測了LRRC3B在NSCLC中的表達情況，并采用轉(zhuǎn)染的方法增加LRRC3B的表達，后通過集落形成實驗，MTT方法以及侵襲實驗驗證其對細胞增殖、細胞侵襲的作用以及其可能機制。我們發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中LRRC3B表達下調(diào)，并且它能夠抑制癌癥細胞的增殖和侵襲。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本課題研究所用人類NSCLC細胞系H460和A549以及H3255購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。本課題研究所用肺癌細胞系用含有10%熱滅活新鮮胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的RPMI-1640（Gibco, Invitrogen, NY,USA）在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染 pCMV6-LRRC3B質(zhì)粒和對照空pCMV6從Origene（Origene, Rockville, MD, USA）購買。采用attractene轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen, Hilden, Germany）進行轉(zhuǎn)染。siLRRC3B序列和對照siRNA序列從Dharmacon（ThermoFisher, USA）購買。采用DharmaFECT 1試劑進行干擾。

1.3 Real-time RT-PCR Real-time PCR采用ABI（Applied Biosystems）SYBR Green mastermix試劑盒。使用ABI 7500快速實時定量PCR系統(tǒng)，目的基因的相對表達量通過2-ΔΔCt方法計算。引物序列如下：LRRC3B Forward：5'TCCAATCATGAGACAGCCCAC 3'，LRRC3B Reverse：5'TCTGCCAGCATGTTCATCCAA 3'；β-actin Forward：5' AT AGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3'，β-actin Reverse：5' CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3'。

1.4 Western blot 總蛋白使用Pierce裂解液（ThermoFisher,USA）提取。Bradford方法進行蛋白定量。上樣蛋白量為60 μg。電泳、轉(zhuǎn)?。?0 V, 120 min）、5%脫脂奶粉封閉，抗LRRC3B（1：800, Sigma, USA） 抗cyclinD1、MMP9（1：1,000, Cell Signaling, USA），4 ℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗（1：2,500, Santa Cruz, USA）37 ℃孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（DNR, Jerusalem,Israe）采集[10]。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染后將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔約2,000個細胞，培養(yǎng)24 h，每孔加入20 mL 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽 （3-[4,5-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）溶液（5 mg/mL, Sigma, USA）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO, Sigma, USA），振蕩10 min，490 nm波長下測定各孔光吸收值，實驗重復(fù)3次，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線[11]。

1.6 集落形成實驗 集落形成實驗在轉(zhuǎn)染48 h后接種1,000個細胞在6 cm培養(yǎng)皿中2周后用吉姆薩染色液（Giemsa）染色。以50個細胞計為是1個克隆。

1.7 細胞侵襲實驗 細胞侵襲實驗使用有8 μm孔徑膜的24-well Transwell（Costar, Cambridge, MA）膜被20 μL膠（1：3, BD Bioscience, San Jose, CA, USA）覆蓋。轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化細胞，含3×105個細胞的100 μL無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到人工基底膜室上部并孵化16 h。中途補充10%FBS到下室作為引誘物。培養(yǎng)后，上室表面未侵襲的細胞用棉花擦除，通過孔徑的細胞用4%多聚甲醛固定并用蘇木精染色。在顯微鏡下隨機選擇10個視野統(tǒng)計入侵細胞，實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果采用t檢驗進行分析，數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 在肺癌細胞系中LRRC3B下調(diào)并抑制細胞增殖和侵襲 肺癌細胞系中通過Western blot和Real time RT-PCR分析LRRC3B的相對表達水平。與組織樣本一致，與正常NHBE細胞系相比，NSCLC細胞系中LRRC3B蛋白表達量顯著下調(diào)，特別是H460、H358、HCC827以及A549（圖1A）。選用A549和H460細胞系進行LRRC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來上調(diào)LRRC3B水平。通過Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率（圖1B）。

在A549和H460細胞系中上調(diào)LRRC3B水平顯著地抑制細胞增殖率（ControlvssiRNA at day 5, A549： 0.783±0.032vs0.568±0.028,P＜0.05; H460： 1.397±0.051vs1.076±0.056,P＜0.05）和集落形成能力（ControlvssiRNA, A549：426±37.3vs135±26.8,P＜0.05; H460： 257±35.5vs118±20.3,P＜0.05）（圖2A和圖2B）。為了驗證LRRC3B對細胞侵襲的影響，使用A549和H460細胞進行基底膜基質(zhì)侵襲實驗。圖2C顯示，與對照組相比，細胞轉(zhuǎn)染LRRC3B后侵襲能力明顯降低（A549： 59.7%; H460： 65.1%）。

2.2 LRRC3B抑制細胞周期進程并調(diào)控cyclin D1和MMP9表達 之前實驗結(jié)果顯示LRRC3B導(dǎo)致細胞增殖和侵襲能力的降低。我們進一步分析LRRC3B在細胞周期進程中的角色，如圖3A所示，在H460和A549細胞系中LRRC3B上調(diào)能夠抑制細胞G1期到S期的推進。為了了解可能的機制，我們檢測了一系列與生長和侵襲相關(guān)的蛋白。如圖3B所示，轉(zhuǎn)染LRRC3B明顯抑制細胞周期蛋白cyclin D1以及與侵襲相關(guān)的蛋白MMP9的表達。

2.3 LRRC3B抑制細胞的增殖和侵襲 在肺癌細胞系H3255中通過siRNA敲除LRRC3B，進一步分析LRRC3B的生物學功能。如圖4A-圖4D所示，LRRC3B敲除后提高了H3255的增殖率，提升了細胞的集落形成能力以及侵襲能力。另外，在LRRC3B敲除的細胞中，MMP9和cyclin D1的表達略微上調(diào)（圖4E）。

3 討論

圖1 LRRC3B在肺癌細胞系中的表達以及轉(zhuǎn)染效率。A：通過Western blot以及Real-time RT-PCR檢測NHBE和幾株肺癌細胞系中LRRC3B的表達，與NHBE相比，A549，H358，H460和HCC827中LRRC3B的表達明顯下調(diào)。B：Western blot 分析顯示：與對照組相比，在A549和H460細胞中，LRRC3B轉(zhuǎn)染顯著增加了LRRC3B的水平。Fig 1 The expression of LRRC3B in lung cancer cells and transfection efficiency of LRRC3B in A549 & H460. A: The expression of LRRC3B is detected in NHBE and several lung cancer cells through western blot and Real-time RT-PCR. The expression of LRRC3B is downregulated in A549, H358, H460 and HCC827 cells; B: The analysis result indicates that LRRC3B transfection upregulates the expression of protein LRRC3B in A549 and H460 cells.

圖2 恢復(fù)LRRC3B表達抑制細胞增殖和侵襲。A：轉(zhuǎn)染LRRC3B質(zhì)粒的A549和H460細胞進行MTT實驗；B：轉(zhuǎn)染LRRC3B質(zhì)粒以及空白對照的細胞進行集落形成實驗，結(jié)果顯示恢復(fù)LRRC3B表達明顯降低集落形成能力；C：惡性侵襲實驗顯示A549和H460細胞中轉(zhuǎn)染LRRC3B后降低細胞侵襲能力。*P＜0.05。Fig 2 Upregulating the expression of LRRC3B inhibits cell growth and invasion. A: MTT assays of A549 and H460 cells transfected with LRRC3B; B:Colony formation assays of A549 and H460 cells transfected with LRRC3B; C: Transwell result shows that LRRC3B transfection weakens the activity of invasion of A549 and H460 cells. *P＜0.05.

圖3 轉(zhuǎn)染LRRC3B抑制細胞周期進程，下調(diào)cyclin D1和MMP9表達量。A：細胞周期分析顯示轉(zhuǎn)染LRRC3B降低S期細胞比率，增加G1期細胞比率；B：Western blot分析顯示恢復(fù)LRRC3B的水平可以減少cyclin D1和MMP9蛋白的表達。Fig 3 LRRC3B transfection inhibits the process of cell cyle and downregulates the expression of cyclin D1 & MMP9. A: The analysis of cell cycle reveals that LRRC3B transfection decreases the rate of S phase and increases the rate of G1 phase; B: The analysis of Western blot shows that LRRC3B downregulates the expression of cyclin D1 and MMP9.

通過對一些癌癥患者的調(diào)查表明，LRRC3B失活是由甲基化或去甲基化導(dǎo)致的。在胃癌，結(jié)直腸癌和透明細胞腎細胞癌中發(fā)現(xiàn)LRRC3B mRNA表達降低且LRRC3B的啟動子區(qū)域去甲基化。在胃癌細胞中通過轉(zhuǎn)染上調(diào)LRRC3B的表達水平能夠抑制集落形成[12,13]。然而，截至目前還沒有研究涉及LRRC3B蛋白在肺癌組織中的表達水平及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。另外，LRRC3B在人類NSCLC中的生物學功能尚不明確。我們的研究顯示與正常支氣管細胞NHBE相比，9株肺癌細胞系中有4株細胞系其LRRC3B的表達水平偏低。通過LRRC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在LRRC3B表達較低的NSCLC細胞株中恢復(fù)內(nèi)源性表達，結(jié)果顯示LRRC3B能夠顯著抑制細胞增殖和細胞周期進展。LRRC3B在腎細胞癌中也可以抑制集落的形成[14]。我們的結(jié)果與這些研究保持一致，提示LRRC3B在肺癌細胞中是一種重要的腫瘤抑制基因。至今為止，LRRC3B在細胞周期進程和細胞侵襲活動中的作用研究尚不透徹。LRRC3B作為一個腫瘤抑制基因的機制尚未闡明。因此，我們調(diào)查細胞周期進程及其相關(guān)蛋白并發(fā)現(xiàn)LRRC3B上調(diào)能夠降低S期百分比和cyclinD1表達量。CyclinD1在細胞周期進程G1到S期的過程中發(fā)揮重要作用。許多研究[15,16]證明cyclinD1在NSCLC中過表達并與惡性增殖和預(yù)后不良相關(guān)。這些結(jié)果表明LRRC3B可以通過調(diào)節(jié)cyclinD1的表達來調(diào)控細胞周期進程。LRRC3B在細胞侵襲過程中的作用之前還沒有報導(dǎo)。在本次課題研究中，我們發(fā)現(xiàn)LRRC3B能夠抑制肺癌細胞的侵襲能力。LRRC3B轉(zhuǎn)染能夠下調(diào)MMP9的表達，MMP9在許多類型的癌癥中是入侵的一個重要中介[17-20]。因此，LRRC3B抑制細胞侵襲的功能可能是通過下調(diào)MMP9的表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，這項研究證明在NSCLC中LRRC3B蛋白水平下調(diào)，恢復(fù)肺癌細胞系中LRRC3B的表達可以抑制細胞增殖和侵襲，作用機制可能是通過調(diào)控cyclinD1和MMP9表達量來實現(xiàn)的。綜合這些發(fā)現(xiàn)，我們推斷LRRC3B是NSCLC中非常重要的腫瘤抑制基因，通過抑制細胞增殖以及侵襲的方式來調(diào)控腫瘤的發(fā)展進程。進一步研究其分子機制，分析他與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，可能會為腫瘤治療提供一個新的靶點。

圖4 LRRC3B抑制細胞生長侵襲并下調(diào)cyclin D1和MMP9的表達。A：Western blot分析顯示，與對照組相比，LRRC3B siRNA明顯降低H3255細胞中LRRC3B的水平；B：MTT實驗顯示LRRC3B抑制細胞生長；C：集落形成實驗顯示LRRC3B減少細胞集落形成數(shù)目；D：侵襲實驗顯示LRRC3B抑制H3255細胞侵襲；E：Western blot分析顯示，LRRC3B敲除略微上調(diào)cyclin D1和MMP9的表達。*P＜0.05。Fig 4 LRRC3B inhibits cell growth & invasion and downregulates the expression of cyclin D1 & MMP9. A: The analysis of Western blot reveals that LRRC3B siRNA downregulates the expression of LRRC3B in H3255 cells; B: MTT assays shows that LRRC3B inhibits cell growth; C: Colony formation assays shows that LRRC3B reduces the quantity of cell colony; D: Transwell assays reveals that LRRC3B inhibits cell invasion; E: The analysis of Western blot shows that LRRC3B siRNA upregulates the expression of cyclin D1 and MMP9 tinily. *P＜0.05.