劉滔滔，劉明瑞，劉恒嘉，杜麗琴，梁智群，韋宇拓**

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧　530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧　530005)

?

產(chǎn)堿假單胞菌堿性脂肪酶的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)*

劉滔滔1,2，劉明瑞1,2，劉恒嘉1,2，杜麗琴1,2，梁智群1,2，韋宇拓1,2**

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530005)

【目的】為獲得可應(yīng)用于酯類水解及合成的脂肪酶資源，本研究通過篩選分離得到能夠水解長鏈脂肪酸酯的脂肪酶產(chǎn)生菌，克隆表達(dá)其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)?！痉椒ā繌沫h(huán)境中篩選分離出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株，利用16S rDNA對其進(jìn)行分子鑒定，并擴(kuò)增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侶基因。以pET-22b(+)為表達(dá)載體，構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)，并對重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究?！窘Y(jié)果】經(jīng)16S rDNA鑒定該菌株為產(chǎn)堿假單胞菌Pseudomonasalcaligenes。通過PCR成功克隆到該菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侶基因(lipPA-9B)，并構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-lipPA-9A-9B，實(shí)現(xiàn)脂肪酶LIP-9A的活性表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)研究表明LIP-9A的最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH值為10.5，最適反應(yīng)底物為對硝基苯酚辛酸酯(pNPO)；同時，LIP-9A還可以催化醇和羧酸發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生酯類物質(zhì)?！窘Y(jié)論】LIP-9A在堿性條件下具有較高活力，且可以催化酯化反應(yīng)，在洗滌行業(yè)和酯合成領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。

產(chǎn)堿假單胞菌堿性脂肪酶共表達(dá)酯化

0　引言

【研究意義】脂肪酶(EC.3.1.1.3)又稱為三酰基甘油?；饷?，是催化甘油三酯分解成甘油和脂肪酸的酯鍵水解酶[1]。脂肪酶除了能在油水界面催化酯鍵的水解，還能催化酸解、醇解、氨解、轉(zhuǎn)酯化以及酯合成等反應(yīng)[2]，從而被廣泛應(yīng)用于食品加工、手性拆分、洗滌和生物能源等領(lǐng)域。【前人研究進(jìn)展】多數(shù)從環(huán)境中獲得的脂肪酶需要通過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，然而脂肪酶的過表達(dá)容易形成包涵體，如Aamand等[3]對來自Pseudomonas cepacia的胞外脂肪酶LipA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LipA在缺乏脂肪酶分子伴侶蛋白LimA的情況下只能產(chǎn)生無活性脂肪酶。Jorgensen等[4]研究發(fā)現(xiàn)在洋蔥伯克霍爾德菌lipB基因?qū)χ久富騦ipA的活性表達(dá)是必需的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從環(huán)境中篩選出可水解長鏈脂肪酸酯的脂肪酶資源，研究酶的基本性質(zhì)，降低酶的生產(chǎn)成本，提高酶的轉(zhuǎn)化效率。【擬解決的關(guān)鍵問題】以三硬脂酸甘油酯為底物，從土壤中篩選出對長鏈脂肪酸酯具有較高水解能力的野生菌，克隆其脂肪酶基因并實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，再深入研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料

樣品：廣西南寧市周邊采集的富油土樣。

菌株和載體：Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli Rosetta(DE3)、E.coli Trans10、pMD19-T、pET-22b(+)、pET-30a(+)。

酶和試劑：限制性內(nèi)切酶和PCR擴(kuò)增聚合酶購自大連TaKaRa公司，T4 DNA連接酶購自Toyobo公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒以及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自BioFlux公司。IPTG和X-gal購自Gibco公司，三硬脂酸甘油酯購自TCI公司，對硝基苯酚及對硝基苯酚酯底物購自sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

篩選平板培養(yǎng)基(W/V)：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%，底物乳化液1%，維多利亞藍(lán)B 0.02%，參考文獻(xiàn)[5]并作一定修改。

橄欖油乳化液：3%(V/V)的聚乙烯醇與橄欖油以體積比3∶1混合均勻。

三硬脂酸甘油酯乳化液：取1 g三硬脂酸甘油酯溶于10 mL 3%(V/V)聚乙烯醇溶液中，溶解后再于超聲波破胞儀中乳化20 min。

1.2方法

1.2.1高產(chǎn)脂肪酶野生菌的篩選

取5 g土樣加入50 mL無菌水，搖床震蕩20 min，制成菌懸液，過濾后梯度稀釋上清液，并涂布橄欖油平板于37℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行初篩，再經(jīng)三硬脂酸甘油酯平板進(jìn)行復(fù)篩，最后通過搖瓶發(fā)酵測定酶活力，選擇較高活力的菌株進(jìn)行研究。

1.2.2野生菌株16S rDNA鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建

以篩選出的野生菌總DNA(DNA提取方法參考文獻(xiàn)[6])為模板，利用16S rDNA為通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD19-T載體后送測序，將測序獲得的16S rDNA序列進(jìn)行Blast N分析，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3脂肪酶基因保守區(qū)序列的克隆

檢索Genbank數(shù)據(jù)庫中已公布的產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶基因序列，比對分析尋找序列保守區(qū)。設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后送測序。

1.2.4脂肪酶基因lipPA-9A的克隆與表達(dá)

比對分析保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增lipPA-9A的引物。上游引物：5′-CCGGAATTCATGGGCCTGTTCGGCTCCACCGGCTACACCAA-3′(下劃線處為 EcoR Ⅰ限制性酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CCCAAGCTTTCAGAGGCCGGCCAGCTTCA-3′(下劃線處為 Hind Ⅲ限制性酶切位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后，與表達(dá)載體pSE380連接構(gòu)建成pSE-lipPA-9A重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，挑選陽性克隆子接種于含有0.1 mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.6左右，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在20℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，SDS-PAGE分析其表達(dá)產(chǎn)物并檢測粗酶活。

脂肪酶酶活力測定方法[7-8]：以異丙醇為溶劑，配制終濃度為20 mmol/L的底物溶液作為母液；取10 μL底物母液與180 μL反應(yīng)緩沖液混勻加入1.5 mL 離心管，預(yù)熱5 min；加入10 μL酶液，空白對照用相應(yīng)的緩沖液代替，在實(shí)驗(yàn)所需條件下反應(yīng)10 min后，加入200 μL 10%(V/V)三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，靜置5 min；加入200 μL 10%(W/V)的Na2CO3溶液顯色，混勻。用酶標(biāo)儀于405 nm處測吸光值,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

脂肪酶酶活力單位(U)定義：每分鐘分解底物釋放出1 μmol 對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。

1.2.5脂肪酶分子伴侶基因lipPA-9B的克隆表達(dá)

以篩選菌PA-9的總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增lipPA-9B，上游引物：5′-CGCCATATGGTGAACAAGCCGCTGCTATT-3′(下劃線處為 Nde Ⅰ限制性酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-GGAAGATCTTCAGAGTTTCTTTTCCCGGC-3′(下劃線處為Bgl Ⅱ限制性酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nde Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切后，與pET-30a(+)連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-lipPA-9B并轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物命名為LIP-9B并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6脂肪酶包涵體變復(fù)性驗(yàn)證

包涵體的變復(fù)性采用一次稀釋法[9]。將包涵體溶解于變性液，離心后取上清液進(jìn)行稀釋復(fù)性。用含分子伴侶LIP-9B的復(fù)性緩沖液分別以25,50,75,100,150和300倍稀釋樣品，同時以不含LIP-9B的復(fù)性緩沖液稀釋到相同倍數(shù)作為空白對照，4℃保存1 h。按1.2.4節(jié)下脂肪酶酶活力測定方法，以pNPP為底物檢測酶活力。

1.2.7lipPA-9A與lipPA-9B共表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

lipPA-9B和lipPA-9A分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切過夜，膠回收目的片段連接pET-22b(+)載體，先后串聯(lián)基因lipPA-9A和lipPA-9B構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-lipPA-9A-9B，其中兩個基因5′端均具有rbs和信號肽序列，如圖1所示。

圖1重組質(zhì)粒pET22b-lipPA-9A-9B的構(gòu)建

Fig.1The schematic of pET22b-lipPA-9A-9Bconstruction pattern

將共表達(dá)質(zhì)粒pET22b-lipPA-9A-9B轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)，挑選陽性克隆子接種于含有0.1 mg/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.6左右，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，20℃、200 r/min搖床培養(yǎng)20 h。胞內(nèi)外重組蛋白表達(dá)情況用SDS-PAGE檢測，并以對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)為底物檢測脂肪酶活力。

1.2.8重組酶LIP-9A酶學(xué)性質(zhì)鑒定

(1)溫度和pH值對LIP-9A酶活力的影響

以對硝基苯酚辛酸酯(pNPO)為底物，在pH值為7.0的反應(yīng)緩沖液中，分別在20～65℃(間隔5℃)下測定溫度對酶活力的影響。在最適反應(yīng)溫度下，用pH值6.0～12.0(間隔0.5)的緩沖液(氫氧化鈉-檸檬酸-磷酸-硼酸緩沖液，參考文獻(xiàn)[10])稀釋LIP-9A適當(dāng)倍數(shù)，測定pH值對酶活力的影響。

(2)溫度和pH值對LIP-9A穩(wěn)定性的影響

熱穩(wěn)定性：以pNPO為反應(yīng)底物，將LIP-9A分別在25～55℃(間隔5℃)保溫1 h，在最適反應(yīng)條件下測定殘余酶活力。

pH值穩(wěn)定性：以pNPO為反應(yīng)底物，用pH值5.0～11.0(間隔0.5)的緩沖液稀釋LIP-9A相同倍數(shù)后，置于4℃保存24 h，在最適反應(yīng)條件下測定其殘余酶活力。

(3)LIP-9A底物特異性測定

分別以不同鏈長的對硝基苯酚酯(C2～C16)為底物在最適反應(yīng)條件下測定重組酶酶活力，測定重組酶的最適反應(yīng)底物。

(4)金屬離子對重組酶LIP-9A活力的影響

用終濃度為5 mmol/L的金屬離子緩沖液稀釋重組酶LIP-9A(總反應(yīng)體系為200 μL)，以不添加金屬離子的酶反應(yīng)液為對照組，在最適反應(yīng)條件下研究金屬離子對酶活力的影響。

(5)化學(xué)試劑對LIP-9A活力的影響

按1%、5%和10%(W/V)的添加比例將非離子型表面活性劑和離子型表面活性劑加到酶反應(yīng)體系中(總反應(yīng)體系為200 μL，對照組不加表面活性劑)，在最適反應(yīng)條件下測定相對殘余酶活力。

取適量的EDTA、DTT和β-巰基乙醇按終濃度1 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L加到酶反應(yīng)體系中(總反應(yīng)體系為200 μL)。以未加化學(xué)試劑的為對照組，在最適反應(yīng)條件下測定相對殘余酶活力。

將有機(jī)試劑(甲醇、乙醇、正丁醇、正己醇、1，2-丙二醇、丙三醇、甲苯、乙腈、丙酮、DMSO、DMF、三氯甲烷、四氫呋喃、吡啶)以10%(V/V)的比例加到200 μL的反應(yīng)體系中，混勻。以不加有機(jī)試劑的酶反應(yīng)液為對照組，在最適反應(yīng)條件下檢測相對殘余酶活力。

(6)重組酶LIP-9A酯化反應(yīng)的檢測

酯化反應(yīng)：100 mmol/L醇、100 mmol/L酸、5 mL正己烷、10 mg酶粉(反應(yīng)體系5 mL)，35℃反應(yīng)10 h，取1 mL反應(yīng)液8 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行氣相色譜分析，對照組不添加凍干酶粉。其中，醇包括乙醇、丁醇、己醇和辛醇，酸包括乙酸和丁酸。酯化率通過GC測定醇的消耗量間接計(jì)算得出，即酯化率Y=消耗醇的量/加入總醇的量×100%。

氣相色譜檢測條件：氣相色譜柱為HP-5，進(jìn)樣口溫度為240℃，壓力為10.896 psi，進(jìn)樣分流比為20∶1，流速為1.2 mL/min，檢測溫度從60℃開始，保留2 min，以每分鐘20℃的速度升至240℃，檢測器溫度為300℃。

2　結(jié)果和分析

2.1高產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

本實(shí)驗(yàn)利用三硬脂酸甘油酯為底物最終篩選到6株可水解該底物的脂肪酶產(chǎn)生菌(圖2)。通過搖瓶發(fā)酵檢測粗酶活力，最終篩選得到一株脂肪酶酶活力最高的菌株，命名為PA-9。

圖2產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選結(jié)果

Fig.2Result of screening lipase-producing microorganisms

2.2PA-9的分子鑒定和進(jìn)化樹的構(gòu)建

將所得的產(chǎn)脂肪酶菌株P(guān)A-9 16S rDNA序列在NCBI中進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明該序列與Pseudomonas alcaligenes strain NBRC 14159的16S rDNA一致性為99%，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，初步鑒定PA-9為Pseudomonas alcaligenes菌株。

2.3脂肪酶基因的克隆表達(dá)

2.3.1PA-9脂肪酶基因保守區(qū)序列的克隆

利用簡并引物成功克隆出一條約500 bp的目的片段，Blast N分析表明保守區(qū)序列與來自Pseudomonas alcaligenes NBRC 14159的假定脂肪酶基因(putative lipase)一致性最高，同源性為99%，可初步判斷該片段屬于脂肪酶。

圖3菌株P(guān)A-9 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequences of strain PA-9

2.3.2PA-9脂肪酶基因lipPA-9A克隆表達(dá)

根據(jù)保守區(qū)序列的比對分析，以PA-9總DNA為模板，擴(kuò)增出約900 bp的DNA片段，重組質(zhì)粒pSE-lipPA-9A轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)(圖4)，SDS-PAGE結(jié)果顯示在菌體中重組蛋白條帶明顯，破胞上清液沒有重組蛋白表達(dá)條帶，也檢測不到脂肪酶活力，因此推斷l(xiāng)ipPA-9A在大腸桿菌中表達(dá)為包涵體。

M:Protein marker；a1:pET-22b whole cell lysate；a2:pSE-lipPA-9Awhole cell lysate；a3:pSE-lipPA-9Acell lysate’s supernatant

圖4LIP-9A的SDS-PAGE分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of LIP-9A

2.4脂肪酶分子伴侶基因lipPA-9B的克隆表達(dá)

以PA-9總DNA為模板，擴(kuò)增lipPA-9B并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-lipPA-9B，再轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖5)。結(jié)果表明lipPA-9B得到大量可溶性表達(dá)，大小為38 kDa左右。

M： Protein marker；b1：pET-22b whole cell lysate；b2：pET-lipPA-9Bwhole cell lysate；b3：pET-lipPA-9Bcell lysate’s supernatant

圖5LIP-9B的SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGE analysis of LIP-9B

2.5脂肪酶包涵體變性及復(fù)性研究

含有分子伴侶LIP-9B的復(fù)性液對LIP-9A包涵體蛋白的復(fù)性效果較好，不同稀釋倍數(shù)均能檢測到酶活力且以50倍稀釋倍數(shù)最佳，空白對照組均檢測不到脂肪酶活力。因此推斷本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的LIP-9A需要其特異的分子伴侶蛋白LIP-9B的幫助折疊才能形成有活力的脂肪酶。

2.6共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-lipPA-9A-9B的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

從圖6中可以看出，lipPA-9A和lipPA-9B均獲得表達(dá)，大小分別為38 kDa和32 kDa，與預(yù)期大小相符合。在破胞上清液中，有一條很明顯的LIP-9B蛋白條帶，而LIP-9A的可溶性表達(dá)量少，蛋白條帶不明顯。通過檢測其脂肪酶活力，胞外發(fā)酵液對pNPP的水解活力為997 U/L。因?yàn)榭扇苄员磉_(dá)量很少，因此本實(shí)驗(yàn)以胞外重組酶LIP-9A為研究對象，將發(fā)酵液通過超濾濃縮并脫鹽得到LIP-9A粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.7重組酶LIP-9A的酶學(xué)性質(zhì)

(1)最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

以pNPO為反應(yīng)底物時，LIP-9A最適反應(yīng)溫度是35℃(圖7a)。LIP-9A在4～35℃條件下酶活力較穩(wěn)定，相對殘余酶活力能保持在80%以上；而在35℃以上酶的殘余活力迅速降低，熱穩(wěn)定性較差(圖7b)。

(2)最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

由圖8a可知，以pNPO為反應(yīng)底物時，LIP-9A的最適反應(yīng)pH值是10.5。LIP-9A在pH值為6.5～8.0緩沖液中穩(wěn)定性較好，保存24 h后的殘余酶活力仍保持在80%以上(圖8b)，LIP-9A最適反應(yīng)pH值以及pH穩(wěn)定性表明該脂肪酶在洗滌工業(yè)具有一定的應(yīng)用價值。

M：Protein marker；c1：pET-22b whole cell lysate；c2：pET22b-lipPA-9A-9Bwhole cell lysate；c3：pET22b-lipPA-9A-9Bcell lysate’s supernatant

圖6　LIP-9A和 LIP-9B的SDS-PAGE分析

圖7溫度對重組酶LIP-9A活性的影響

Fig.7Effect of temperature on recombinant enzyme

(3)重組酶LIP-9A的底物特異性

由圖9可知，重組酶LIP-9A對對硝基苯酚乙酸酯pNPA(2C)、對硝基苯酚丁酸酯pNPB(4C)、對硝基苯酚己酸酯pNPH(6C)、pNPO(8C)和pNPP(16C)都有一定的水解作用，且偏好水解長鏈脂肪酸酯類底物，特別是對pNPO(8C)具有最高水解活力，說明LIP-9A在酯類水解反應(yīng)中具有一定應(yīng)用價值。

(4)金屬離子對LIP-9A活性的影響

由圖10可知，Mn2+對酶活力的抑制作用比較強(qiáng)烈，K+、Ba2+、Fe3+、Mg2+和Ca2+對酶活力有輕微的抑制作用，而Zn2+、Pb2+、Cu2+和Co2+對LIP-9A的活力影響不大。

圖8　pH值對重組酶LIP-9A活性的影響

圖9重組酶LIP-9A的底物特異性測定

Fig.9Substrate specificity of the recombinant enzyme LIP-9A

圖10金屬離子對重組酶LIP-9A活性的影響

Fig.10Effect of metal ions on recombinant enzyme LIP-9A

(5)化學(xué)試劑對LIP-9A活性的影響

由表1中可以看出，1%、5%和10%(W/V)的非離子型表面活性劑和離子型表面活性劑均對重組酶LIP-9A的具有強(qiáng)烈的抑制作用。

表1表面活性劑對重組酶LIP-9A活性的影響

Table 1Effect of detergents on recombinant enzyme LIP-9A

試劑Detergent濃度Concentration(%)Residueactivity(%)None-100NonionicdetergentTween2010.89±0.8150.97±0.82101.79±1.15Tween8012.06±0.5552.1±2.44106.54±0.79TritonX10011.45±1.3753.72±2.11102.26±2.22IonicdetergentSDS0.110.80±1.720.51.68±0.6411.19±2.52CTAB0.19.59±2.120.58.94±5.9015.73±4.48

由圖11可知，1～10 mmol/L的EDTA對重組酶LIP-9A均有輕微的抑制作用，高濃度的DTT和β-巰基乙醇強(qiáng)烈抑制LIP-9A的活性。10%(W/V)的丙酮和DMSO對LIP-9A的活性沒有明顯影響，其他有機(jī)試劑對重組酶LIP-9A活性均有不同程度的抑制作用。

(6)LIP-9A的酯化反應(yīng)

LIP-9A能夠催化醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng)，其中對乙酸和己醇、辛醇的酯化率分別為5.1%和4.2%，對丁酸和乙醇、丁醇以及己醇的酯化率分別為59.2%、4.0%和5.3%。說明 LIP-9A所具有酯化性質(zhì),在生物催化領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。

3　結(jié)論

大多數(shù)細(xì)菌脂肪酶都是采用GSP分泌途徑進(jìn)行，通過N端信號肽引導(dǎo)到達(dá)周質(zhì)空間，然后在分子伴侶蛋白的幫助折疊下形成活性蛋白[11]。本研究所篩選到產(chǎn)堿假單胞菌就是以該方式分泌胞外脂肪酶，這與之前已報道的通過構(gòu)建基因文庫所獲得的PAL分泌途徑不同[12]。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，LIP-9A的最適反應(yīng)溫度是35℃，在0～35℃穩(wěn)定性較好；在弱堿性條件下較穩(wěn)定且具有較高的最適pH值10.5；偏好水解長鏈脂肪酸酯類底物，最適底物是pNPO(8C)；LIP-9A可催化酸和醇的酯化反應(yīng)。這些性質(zhì)表明該堿性脂肪酶LIP-9A在生物催化領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價值，今后的工作主要是實(shí)現(xiàn)該酶大量活性表達(dá)并通過分子改造技術(shù)或者固定化技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性，為在洗滌劑和催化合成領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖11化學(xué)試劑對重組酶LIP-9A活性的影響

Fig.11Effect of chemicals on recombinant enzyme LIP-9A

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

Gene Cloning,Expression and Characterization of An Alkaline Lipase from Pseudomonas alcaligenes PA-9

LIU Taotao1,2，LIU Mingrui1,2，LIU Hengjia1,2，DU Liqin1,2,LIANG Zhiqun1,2，WEI Yutuo1,2

(1.College of Life Science & Technology of Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi，530005，China)

【Objective】In order to obtain the lipase that can be applied to the hydrolysis and synthesis of esters,the alkaline lipase-producing strains that hydrolyze long chain fatty acid ester were screened and isolated.The related genes were cloned and expressed, and enzyme characterization was studied.【Methods】A strain,which degraded glycerol tristearate,was isolated from the environment,and identified based on 16S rDNA sequence analyses.Then the lipase gene and the lipase chaperone gene were amplified by PCR.The target geneslipPA-9AandlipPA-9Bwere introduced into expression vector pET-22b(+) and induced for expression in Escherichia coli BL21(DE3).Finally,the characteristics of the recombinant enzyme were studied in detail.【Results】The strain was identified as the genus of Pseudomonas alcaligenes by analyzing of 16S rDNA sequence.And the lipase gene (lipPA-9A) and lipase chaperone gene (lipPA-9B) were cloned.The co-expression recombinant plasmid of pET22b-lipPA-9A-9Bwas successfully constructed and expressed in E.coli BL21(DE3).The maximum activity of LIP-9A was obtained at 35℃,pH 10.5,and pNPO was the most suitable substrate.Meanwhile,the active LIP-9A could catalyze fatty alcohols and fatty acids to generate esters.【Conclusion】LIP-9A is a lipase with relatively high activity in alkaline conditions and can catalyze esterification reaction.Its characteristics are of high value in the detergent industry and biocatalytic applications.

Pseudomonas alcaligenes，alkaline lipase，co-expression，esterification

2016-05-08

2016-06-19

劉滔滔(1991-)，男，碩士研究生，主要從事酶工程研究。

Q78,TQ925+.6

A

1005-9164(2016)03-0248-07

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460437)資助。

**通訊作者：韋宇拓(1971-),男，教授，主要從事發(fā)酵與酶工程研究，E-mail:weiyutuo@gxu.edu.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(3):248～254

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-13【DOI】10.13656/j.cnki.gxkx.20160713.008

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160713.0857.016.html