楊立恩，韓曉磊，周　偉，鄧銀銀，許廣平，胡傳明，朱建一，陸勤勤**,徐建國

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通　226007；2.常熟理工學(xué)院，江蘇常熟　215500;3.江蘇省海洋漁業(yè)指揮部，江蘇南通　226000)

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條斑紫菜不同栽培品系的遺傳多樣性分析*

楊立恩1，韓曉磊2，周偉1，鄧銀銀1，許廣平1，胡傳明1，朱建一2，陸勤勤1**,徐建國3

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通226007；2.常熟理工學(xué)院，江蘇常熟215500;3.江蘇省海洋漁業(yè)指揮部，江蘇南通226000)

2.Changshu Institute of Technology,Changshu,Jiangsu,215500,China;3.Marine Fisheries Dispatching Department of Jiangsu,Nantong,Jiangsu,226000,China)

【目的】確定通過雜交和突變選育出的條斑紫菜(Pyropia yezoensis)栽培品系的遺傳多樣性?！痉椒ā坎捎煤唵沃貜?fù)序列區(qū)間(Inter simple sequence repeat，ISSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphism DNA，RAPD)等3種分子標(biāo)記對條斑紫菜不同栽培品系進(jìn)行遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】3種分子標(biāo)記的多態(tài)性比率分別為38.10%、38.95%和61.75%；所表現(xiàn)出來的不同栽培品系間遺傳距離分別為0.1785,0.1029和0.2845；3種分子標(biāo)記聚類結(jié)果并不完全一致，但可以看出Y-0602、Y-HA01和Y-H001總是聚類在一起，而Y-DL02傾向于單獨(dú)聚為一支?！窘Y(jié)論】通過誘變和雜交所選育的品系，在遺傳角度上仍然屬于條斑紫菜，但已形成不同栽培品系，具有一定的遺傳多樣性。

條斑紫菜遺傳距離分子標(biāo)記栽培品系

0　引言

【研究意義】條斑紫菜(Pyropia yezoensis)是我國長江以北地區(qū)的主要紫菜栽培物種[1]。江蘇是我國條斑紫菜主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模和產(chǎn)量均占全國條斑紫菜的97%以上，行業(yè)年產(chǎn)值超過50億元。江蘇省海洋水產(chǎn)研究所國家級(jí)紫菜種質(zhì)庫長期從事條斑紫菜遺傳育種工作，不僅保存有大量的條斑紫菜基礎(chǔ)種質(zhì)，而且還以此為基礎(chǔ)進(jìn)行誘變、篩選、純化、擴(kuò)增與保存等有關(guān)條斑紫菜優(yōu)良品系選育方面的工作，所選育的優(yōu)良品系長期應(yīng)用于江蘇省紫菜產(chǎn)業(yè)，良種覆蓋率達(dá)到30%以上，對產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定起到不可忽視的作用。因此，鑒定這些基礎(chǔ)種質(zhì)和選育品系之間在分子遺傳學(xué)水平上的關(guān)系至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】分子標(biāo)記被廣泛用于遺傳多樣性分析、品種和種質(zhì)鑒定以及種群親緣關(guān)系等方面的研究。常用的分子標(biāo)記有簡單重復(fù)序列區(qū)間(Inter simple sequence repeat，ISSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphism DNA，RAPD)。這3種分子標(biāo)記所需DNA樣品量少，無需預(yù)先知道受試基因組DNA信息，結(jié)果記錄方便，并可通過0/1矩陣計(jì)算遺傳距離、遺傳相似性指數(shù)、聚類分析等參數(shù)，因而被廣泛應(yīng)用于紫菜栽培品系鑒定和遺傳多樣性的研究工作中[2-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同的分子標(biāo)記各有優(yōu)劣，所表現(xiàn)出來的多態(tài)性也會(huì)在具體數(shù)據(jù)上有所差異，但得出的一致結(jié)論可能更加可靠，因此本研究同時(shí)應(yīng)用ISSR、AFLP和RAPD 3種分子標(biāo)記檢測不同選育品系間的遺傳多樣性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過品系間遺傳距離的比較和聚類分析，確定誘變和雜交所選育出的品系在遺傳角度上是否仍然屬于條斑紫菜。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所采用的條斑紫菜為江蘇省海洋水產(chǎn)研究所國家級(jí)紫菜種質(zhì)庫所保存的野生條斑紫菜種質(zhì)和長期選育的栽培品系(表1)，材料取自研究所與紫菜栽培企業(yè)合作建設(shè)的新品系栽培示范基地。按照Yang等[19]所述方法提取葉狀體基因組DNA，所提取DNA用1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1ISSR擴(kuò)增

ISSR引物為British Columbia大學(xué)公布的第9套引物，由上海生工生物工程有限公司合成。MgCl2、dNTP、rTaq DNA聚合酶等試劑購自Takara公司。PCR反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行。針對多態(tài)性較高的引物，則先對MgCl2、dNTP濃度，引物的退火溫度等因子進(jìn)行優(yōu)化，選用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用混合DNA模板對100條引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，約20 ng的DNA模板和1 U rTaq酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。選擇多態(tài)性高的引物對每個(gè)樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀(Biorad)觀察結(jié)果并拍照記錄。

表1實(shí)驗(yàn)所用的紫菜栽培品系

Table 1Cultivars used in the present study

品系Cultivar來源SourceYQD1993年采自于青島的野生條斑紫菜品系WildcultivarcollectedfromQingdaoin1993YDL01大連條斑紫菜野生種群選育品系(2013年)BreedingcultivarwithgrowthadvantagefrompopulationcollectedfromDalianin2013YDL02大連條斑紫菜野生種群選育品系(2014年)BreedingcultivarwithgrowthadvantagefrompopulationcollectedfromDalianin2014Y0601種藻經(jīng)60Coγ誘變、高光脅迫篩選后于適溫栽培海區(qū)選育(2003年)Cultivarscreenedbyhighlightstressinmoderatetemperaturecoastafterbeingmutatedby60Coγsince2003Y0602種藻經(jīng)60Coγ誘變、高光脅迫篩選后于低溫栽培海區(qū)選育(2003年)Cultivarscreenedbyhighlightstressinlowtemperaturecoastafterbeingmutatedby60Coγsince2003Y06D0具生長優(yōu)勢的栽培群體經(jīng)60Coγ誘變選育(南通,2003年)Breedingcultivarofmutatedpopulationswithgrowthadvantageby60CoγinNantongin2003YHA01海安條斑紫菜栽培海區(qū)選育品系(2011年)BreedingcultivarofgrowthadvantagepopulationcollectedfromcultivationcoastinHai’anin2011YH001條斑紫菜與壇紫菜雜交重組的黑色絲狀體選育品系BreedingcultivarfromblackconchocelisafterhybridizationofP.yezonesisandP.haitanensisYH002條斑紫菜與壇紫菜雜交重組的紅色絲狀體選育品系BreedingcultivarfromredconchocelisafterhybridizationofP.yezonesisandP.haitanensis

1.2.2AFLP擴(kuò)增

取各品系基因組DNA 100 ng，用EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ(20 μL體系)在37℃水浴條件下酶切3 h，酶切片段與EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ接頭在T4連接酶的作用下(25 μL體系)18℃水浴條件下連接過夜。EcoRⅠ接頭序列：5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′和5′-CTGACGCATGGTTAA-3′；Mse Ⅰ接頭序列：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′和5′-TACTCAGGACTCAT-3′。取酶切連接產(chǎn)物5 μL用于預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增引物3′端帶有1個(gè)選擇性堿基，引物序列為E01：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′和M02：5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′，50 μL PCR反應(yīng)體系含有1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，1 U rTaq酶,0.2 μmol/L引物，20 ng DNA模板。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min;95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，20個(gè)循環(huán);72℃ 60 s延伸。PCR產(chǎn)物4℃保存。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1∶15(V/V)稀釋后，用于選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增引物3′端帶有3個(gè)選擇性堿基，選取6對引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，降落PCR，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7℃，12個(gè)循環(huán)后，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，8個(gè)循環(huán)，72℃ 60 s延伸。取選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL于PCR儀上95℃變性2 min，迅速取出置于冰上使其保持變性狀態(tài)，在4.5%(V/V)的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測：電泳緩沖液為1×TBE，保持60 W恒定功率；在不加樣品的情況下先預(yù)電泳30 min，然后將尿素吹凈，在點(diǎn)樣孔加入樣品，電泳至第一條loading buffer指示劑到玻璃板底部時(shí)結(jié)束電泳。銀染參考韓曉磊等[20]方法進(jìn)行。

1.2.3RAPD擴(kuò)增

用混合DNA模板從300條RAPD引物中篩選出多態(tài)性較高的引物，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化rTaq酶、dNTP、引物和Mg2+的濃度，確定PCR反應(yīng)體系為25 μL，含有1.5 U rTaq酶，5% (V/V)DMSO，0.25 mmol/L dNTP，2 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 引物,20 ng DNA模板；梯度PCR(33～43℃)優(yōu)化每條引物的退火溫度。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 45 s，最佳退火溫度 45 s，72℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min。選擇多態(tài)性高的引物對每個(gè)樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.2.4圖譜分析

根據(jù)瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，將圖譜上某一位置出現(xiàn)的條帶記為1，缺失的條帶記為0，強(qiáng)帶和弱帶均記為1，只記錄重復(fù)性好的條帶，得出0/1原始數(shù)據(jù)矩陣。研究使用的遺傳學(xué)參數(shù)主要有：

多態(tài)位點(diǎn)比率P=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)×100%，

遺傳相似性系數(shù)Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)，

遺傳距離D=1-S，

其中：ni為i位點(diǎn)上有帶的品系數(shù)，n為總品系數(shù)；Nxy為品系x和品系y共有的位點(diǎn)數(shù)，Nx和Ny分別為x和品系y的總位點(diǎn)數(shù)；S為相似系數(shù)。

利用PopGen32計(jì)算遺傳相似度、遺傳距離和遺傳多樣性；利用Arlequin進(jìn)行AMOVA分析；利用MEGA5.0構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹。

2　結(jié)果與分析

2.1ISSR分子標(biāo)記結(jié)果

2.1.1ISSR擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)篩選出7個(gè)ISSR引物，對不同栽培品系DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，7個(gè)ISSR引物擴(kuò)增出位點(diǎn)數(shù)目為3～12，共擴(kuò)增產(chǎn)生52個(gè)可統(tǒng)計(jì)的位點(diǎn)，其中31個(gè)位點(diǎn)為9個(gè)品系所共有的ISSR標(biāo)記位點(diǎn)，共有位點(diǎn)百分率為59.62%(表2)。

表2ISSR引物在栽培品系間的擴(kuò)增情況

Table 2Amplification pattern of ISSR between different cultivars

引物編號(hào)PrimerNo.引物序列Primersequence(5'3')位點(diǎn)數(shù)No.ofloci多態(tài)位點(diǎn)數(shù)No.ofpolymorphicloci多態(tài)位點(diǎn)比率(%)Percentofpolymorphicloci809(AG)8G12758.33826(AC)8C8337.50827(AC)8G8337.50830(TG)8G3133.33856(AC)8YA7114.29890VHV(GT)77342.86891HVH(TG)77342.86平均值Mean7.43338.10

2.1.2品系間的遺傳多樣性

在52個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中，多態(tài)位點(diǎn)為21條，多態(tài)位點(diǎn)比率為40.38%。不同品系間的平均遺傳距離為0.1785，平均Shannon’s指數(shù)為0.1143，平均雜合度不大(0.2164)。條斑紫菜不同栽培品系兩兩間的遺傳距離為0.0594～0.3403(表3)。

表3不同栽培品系兩兩間的遺傳距離

Table 3Pairwise genetic distance between different screened cultivars

YQDYDL01YDL02Y0601Y0602Y06D0YHA01YH001YH002YQD—YDL010.3403—YDL020.10110.2136—Y06010.23770.16710.2136—Y06020.16710.19000.14460.1446—Y06D00.19000.21360.16710.21360.2377—YHA010.21360.19000.14460.14460.12260.1900—YH0010.23770.21360.21360.12260.14460.16710.0594—YH0020.14460.26240.12260.16710.14460.16710.14460.1671—

2.1.3聚類分析

基于ISSR遺傳距離，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建9個(gè)栽培品系的UPGMA系統(tǒng)樹(圖1)。從聚類結(jié)果可以看出，Y-QD、Y-DL02、Y-H002和Y-06D0聚在一個(gè)分支內(nèi)，Y-0601、Y-HA01、Y-H001和Y-0602聚為另一個(gè)分支，Y-DL01單獨(dú)聚為一支。

圖1基于ISSR遺傳距離構(gòu)建的栽培品系UPGMA系統(tǒng)樹

Fig.1UPGMA dendrogram of 9 screened cultivars reconstructed by ISSR genetic distance

2.2AFLP結(jié)果

2.2.1AFLP擴(kuò)增結(jié)果

使用6對不同引物對，從9個(gè)栽培品系的DNA樣品中共檢出190個(gè)不同長度的位點(diǎn)(表4)。對190個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，9個(gè)栽培品系共有的AFLP標(biāo)記位點(diǎn)有116個(gè)(共有位點(diǎn)百分比為61.05%)。不同引物的擴(kuò)增結(jié)果存在差異，產(chǎn)生的位點(diǎn)從24到42不等，擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)為4～17條，多態(tài)位點(diǎn)比率為16.67%～53.57%。另外，從表4可見各引物組合的總位點(diǎn)數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表4不同AFLP引物對的擴(kuò)增結(jié)果

Table 4Number of bands generated by AFLP primer combinations

引物組合Primercom-bination擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)No.oftotalamplifiedloci多態(tài)位點(diǎn)數(shù)No.oftotalpolymorphicloci多態(tài)位點(diǎn)比率Percentofallpoly-morphicloci(%)E11/M47321443.75E11/M48321546.88E11/M49281553.57E11/M55421740.48E23/M4924416.67E23/M5532928.12總計(jì)Total1907438.95

Note:E11：5′-GACTGCGTACCAATTCAA-3′；E23：5′-GACTGCGTACCAATTCTA-3′；M47：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′；M48：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3′；M49：5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′；M55：5′-GATGAGTCCTGAGTAACGA-3′

2.2.2品系間的遺傳多樣性

在190個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中，多態(tài)位點(diǎn)為74個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率為38.95%。不同栽培品系間遺傳相似度和遺傳距離分別為0.8971和0.1029，品系間的Shannon’s指數(shù)為0.2101，平均雜合度為0.1406。條斑紫菜不同栽培品系兩兩間遺傳距離為0.0402～0.1571(表5)。

表5不同栽培品系兩兩間的遺傳距離

Table 5Pairwise genetic distance between different screened cultivars

YQDYDL01YDL02Y0601Y0602Y06D0YHA01YH001YH002YQD—YDL010.1418—YDL020.13630.1418—Y06010.07250.11470.1545—Y06020.12240.06380.15450.0891—Y06D00.09030.10800.15710.08440.1087—YHA010.13580.08360.12190.10810.04020.0935—YH0010.11260.08890.13310.10590.05370.12670.0882—YH0020.11030.07910.13100.09690.05070.09600.04080.0763—

2.2.3聚類分析

基于AFLP遺傳距離，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建栽培品系的UPGMA系統(tǒng)樹(圖2)。從聚類結(jié)果可以看出，Y-DL02單獨(dú)聚類，Y-QD、Y-0601、Y-06D0聚為一個(gè)分支，Y-DL01、Y-0602、Y-HA01、Y-H001和Y-H002聚類在一起。

圖2基于AFLP遺傳距離構(gòu)建的栽培品系UPGMA系統(tǒng)樹

Fig.2UPGMA dendrogram of screened cultivars reconstructed by AFLP genetic distance

2.3RAPD結(jié)果

2.3.1RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)篩選出27個(gè)RAPD引物，對9個(gè)栽培品系的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，27個(gè)RAPD引物擴(kuò)增出5～18位點(diǎn)，共擴(kuò)增產(chǎn)生274個(gè)可統(tǒng)計(jì)的位點(diǎn)，其中不同栽培品系共有的RAPD標(biāo)記位點(diǎn)有102條(共有位點(diǎn)百分比為37.23%)(表6)。

2.3.2品系間遺傳多樣性

在274個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中，多態(tài)位點(diǎn)為172條，多態(tài)位點(diǎn)比率為62.77%；栽培品系間的平均遺傳距離、Shannon’s指數(shù)和平均雜合度分別為0.2845，0.3281和0.2174。條斑紫菜不同栽培品系兩兩間的遺傳距離為0.1535～0.5072(表7)。

2.3.3聚類分析

基于RAPD遺傳距離，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建條斑紫菜9個(gè)栽培品系的UPGMA系統(tǒng)樹(圖3)。從圖中可以看出，Y-DL02與其他品系分開聚類，Y-0601、Y-0602、Y-06D0、Y-HA01、Y-H001和Y-H002聚類在一起。

表6RAPD引物在栽培品系間的擴(kuò)增情況

Table 6Amplification pattern of RAPD primers between different cultivars

引物編號(hào)PrimerNo.引物序列Primersequence位點(diǎn)數(shù)No.ofloci多態(tài)位點(diǎn)數(shù)No.ofPolymorohicloci多態(tài)位點(diǎn)比率Percentofpolymorphicloci(%)22TGATCCCTGG151066.6756CACACTCCAG10770.0062GGACCCAACC12866.6765TGAGCGGACA12758.3367TTGGCACGGG7342.8682GGTGCGGGAA8225.00114TGCTGCAGGT141285.71118TTCCCGGGTT9555.56119CCTCTAGACC6360.00155AGTCGTCCCC11872.73160GGGAGACATC7342.86170ACAACGCGAG7457.14201CATTCGAGCC11981.82215CTCCTGCCAA181161.11226GAGGGAAGAG151066.67236AGGTTGCAGG5120.00239GAGTGGTGAC10770.00241GTTGGTGGCT14750.00266GAGACGCACA10770.00269TGCCGGCTTG10880.00272CACAGACACC8450.00278GGTGAGGTCA10550.00280GGTGCTCCGT111090.91282ACGTAGCGTC12541.67296TCGGCGGTTC8562.50299GGTGCACGTT9777.78300ACACACGCTG10990.00平均值Mean—10.336.5661.70

表7不同栽培品系兩兩間的遺傳距離

Table 7Pairwise genetic distance between different screened cultivars

YQDYDL01YDL02Y0601Y0602Y06D0YHA01YH001YH002YQD—YDL010.3928—YDL020.46560.5072—Y06010.28040.29500.4257—Y06020.26600.23320.44260.1535—Y06D00.24250.29500.40360.19260.1794—YHA010.28040.25650.44830.20150.20600.2015—YH0010.23320.29500.50720.19260.18820.20150.2472—YH0020.23320.24720.45980.20150.20600.24720.21050.2015—

圖3基于RAPD遺傳距離構(gòu)建的栽培品系UPGMA系統(tǒng)樹

Fig.3UPGMA dendrogram of cultivars reconstructed by RAPD genetic distance

3　討論

ISSR、AFLP和RAPD都是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的分子標(biāo)記技術(shù)，之前的研究證明這3種不同的分子標(biāo)記均可用于紫菜品系鑒定、遺傳多樣性分析等[7，15]。其中ISSR標(biāo)記因其隨機(jī)引物末端帶有錨定堿基，既有高多態(tài)性又有較高穩(wěn)定性； AFLP雖然實(shí)驗(yàn)成本高、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣復(fù)雜、技術(shù)要求高等，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好；RAPD技術(shù)是發(fā)展較早的分子標(biāo)記，因其多態(tài)性高、簡單快捷等特點(diǎn)，被認(rèn)為適用于種質(zhì)庫鑒定、管理工作。陳淑吟等[21]認(rèn)為通過多個(gè)分子標(biāo)記組合使用即能得到可靠的結(jié)論。本研究用ISSR、AFLP和RAPD 3種分子標(biāo)記研究紫菜不同栽培品系遺傳多樣性，結(jié)果顯示不同品系之間平均遺傳距離分別為0.1785，0.1029和0.2845。造成這一結(jié)果的原因可能與不同的分子標(biāo)記所表現(xiàn)出來的多態(tài)性不同有關(guān)，另一個(gè)可能原因是引物組合的多寡也會(huì)引起一定的遺傳距離變化。因此，使用不同的分子標(biāo)記雖然會(huì)在具體數(shù)據(jù)上表現(xiàn)出一定差異，但得出的一致結(jié)論可能更加可靠。

本研究ISSR分子標(biāo)記得出的不同條斑紫菜栽培品系之間遺傳距離為0.0594～0.3403(表3)，這一結(jié)果比陳昌生等[8]所得出的野生壇紫菜種群間遺傳距離(0.0414～0.052)和陳淑吟等[21]所得出的條斑紫菜不同絲狀體種質(zhì)間遺傳距離(0.0392～0.0981)大，但比謝潮添等[15]所得出的壇紫菜不同色澤絲狀體栽培品系間的遺傳距離(0.4410～0.7655)和袁昭嵐等[18]所得出的條斑紫菜不同栽培品系之間遺傳距離(0.3897～0.4469)小。這一結(jié)果可能說明本實(shí)驗(yàn)所研究的不同條斑紫菜栽培品系，包括條斑紫菜和壇紫菜“雜交”選育的Y-H001、Y-H002和誘變選育的Y-0601、Y-0602、Y-06D0等品系，在基因水平上仍然屬于條斑紫菜，經(jīng)過誘變選育，提高種質(zhì)遺傳多樣性，形成不同品系，但仍然需要進(jìn)一步選育以阻止栽培種質(zhì)退化。本實(shí)驗(yàn)AFLP結(jié)果得出條斑紫菜不同栽培品系間遺傳距離為0.0402～0.1571(表5)，比陳奕欣等[7]得出的福建海區(qū)壇紫菜不同栽培種群之間遺傳距離(0.264～0.398)和楊銳等[17]得出的野生壇紫菜不同地理種群和表型種群之間遺傳距離(0.2318～0.6023)小。這一結(jié)果不僅證明條斑紫菜不同栽培品系仍需進(jìn)一步選育以繼續(xù)增大種質(zhì)遺傳多樣性，也反應(yīng)出條斑紫菜和壇紫菜兩個(gè)物種之間的區(qū)別[6]。本實(shí)驗(yàn)RAPD結(jié)果得出條斑紫菜不同栽培品系之間的平均遺傳距離為0.2845，這一結(jié)果與徐滌等[16]得出的條斑紫菜兩個(gè)品系(0.32)和壇紫菜兩個(gè)品系之間(0.31)的遺傳距離相似，但比陳驍?shù)萚6]得出的條斑紫菜兩個(gè)品系(0.029)和壇紫菜不同品系之間的遺傳距離(0.174)大。綜合3種分子標(biāo)記所得的遺傳距離分析，本實(shí)驗(yàn)所研究的不同選育栽培品系，在遺傳角度仍然屬于條斑紫菜，但經(jīng)過雜交或誘變選育后，遺傳距離介于種內(nèi)和品系間，已形成不同的栽培品系，在為生產(chǎn)提供良種確保栽培生產(chǎn)穩(wěn)定的同時(shí)，提高條斑紫菜種質(zhì)遺傳多樣性，確保條斑紫菜栽培種質(zhì)不退化。同時(shí)通過比較發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜不同品系(種群)間遺傳距離與壇紫菜不同品系(種群)間遺傳距離相比較小。

ISSR、AFLP和RAPD對不同條斑紫菜栽培品系的聚類分析結(jié)果顯示，3個(gè)聚類樹并不嚴(yán)格一致(圖1～3)，一方面表明不同分子標(biāo)記之間的差異，另一方面也為所研究的不同品系親緣關(guān)系較近，仍屬條斑紫菜提供證據(jù)。從聚類分析的結(jié)果中可以看出，品系Y-0602、Y-HA01和Y-H001總是聚在一起，而Y-DL02更傾向于聚類在獨(dú)立分支，可能與各個(gè)栽培選育品系親本來源有關(guān)系。

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

Genetic Diversity of Different Cultivars of Pyropia yezoensis

YANG Li’en1,HAN Xiaolei2,ZHOU Wei1,DENG Yinyin1,XU Guangping1,HU Chuanming1,ZHU Jianyi2,LU Qinqin1,XU Jianguo3

(1.Jiangsu Institute of Oceanology & Marine Fisheries,Nantong,Jiangsu,226007,China;

【Objective】Different cultivars were screened and bred by mutation or hybridization,and their genetic diversity was determined.【Methods】Molecular markers ISSR,AFLP and RAPD were employed to analyze the genetic diversity of screened cultivars.【Results】The polymorphism ratio shown by ISSR,AFLP and RAPD was 38.10%,38.95% and 61.75%,respectively.The genetic distance shown by ISSR,AFLP and RAPD between different cultivars of Pyropia yezoensis was 0.1785,0.1029 and 0.2845,respectively.Although the clustering results were not consistent,the cultivars Y-0602,Y-HA01 and Y-H001 always clustered together,whereas Y-DL02 tended to cluster as outgroup.【Conclusion】After being screened and bred by mutation or hybridization,the cultivars studied in the present paper are genetically the same species as P.yezoensis but essentially different cultivars with certain genetic diversity.

Pyropia yezoensis，genetic distance，molecular markers，cultivars

2016-05-10

2016-06-15

楊立恩(1983-)，男，助理研究員，主要從事紫菜分子生物與生理學(xué)研究。

S326,S968.43+1

A

1005-9164(2016)03-0241-07

*國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31272664)，國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201105023)，南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目(MS22015026)和江蘇省水產(chǎn)三新工程重大項(xiàng)目(D2015-18)資助。

**通訊作者：陸勤勤(1964-)，男，研究員，主要從事條斑紫菜育種與栽培學(xué)研究，E-mail:jsntlqq@163.com。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(3):241～247

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-07-13【DOI】10.13656/j.cnki.gxkx.20160713.012

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160713.0859.024.html