張　亞，肖保衡，吳明江

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州　325035)

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熱提羊棲菜多糖對黑腹果蠅生長的影響*

張亞，肖保衡，吳明江**

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035)

【目的】研究經(jīng)熱提醇沉得到的羊棲菜多糖(SFPs)對黑腹果蠅生長的影響?！痉椒ā坎捎?5℃熱水煮提，乙醇沉淀，氯化鈣去除褐藻淀粉等多種工序提取羊棲菜多糖，并分析其化學(xué)性質(zhì)；以黑腹果蠅為實驗對象，研究羊棲菜多糖濃度對黑腹果蠅幼蟲體型、體重和羽化的影響?！窘Y(jié)果】經(jīng)熱提醇沉得到的羊棲菜多糖純度較高，總糖含量高達81.93%，分子量和單糖組成較穩(wěn)定。與對照組相比，經(jīng)羊棲菜多糖處理后，黑腹果蠅在體型和體重上均有增加。實驗組0.1%♀和1.5%♀與對照組CK♀存在顯著差異(P<0.05)，0.5%♀組與對照組CK♀存在極顯著差異(P<0.01)；實驗組0.1%♂、0.5%♂、1.5%♂與對照組CK♂存在顯著差異，但實驗組之間并沒有顯著差異，其中1.5%♂組增重最為明顯。實驗組與對照組在幼蟲孵化率上存在顯著差異；對照組黑腹果蠅從卵至羽化為5～8 d，0.1%和0.5%組為6～9 d，1.5%組為6～10 d。0.1%♀、1.5%♀、0.1%♂組與相對應(yīng)的對照組相比，羽化數(shù)量存在顯著差異；對比羽化成蟲雌雄比例，只有1.5%組與CK組存在顯著差異?！窘Y(jié)論】經(jīng)熱提醇沉法提取的羊棲菜多糖性質(zhì)穩(wěn)定，能降低黑腹果蠅幼蟲羽化率，延長幼蟲羽化時間，對果蠅后代的雌雄比例略有影響，同時可以增大成蟲體型，增加成蟲體重。

羊棲菜多糖(SFPs)黑腹果蠅羽化率體型體重

0　引言

【研究意義】羊棲菜(Sargassum fusiforme)隸屬于褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬，北起遼東半島，南至雷州半島，以浙江沿海最多。它是一種營養(yǎng)豐富的食用藻，享有“長壽菜”的盛譽。羊棲菜多糖包括褐藻酸(alginic acid)、褐藻多糖硫酸酯(fucoidan,FCD)及褐藻淀粉(laminaran)，其中褐藻多糖硫酸酯活性研究最為廣泛。近年研究揭示，羊棲菜多糖不僅是一種非常有潛力的天然抗氧化劑，而且在治療腫瘤、心血管疾病、降低血糖和延緩衰老等方面都有一定的效果，具有廣闊開發(fā)前景，日本已有相關(guān)飲品和保健品等銷售[1]?！厩叭搜芯窟M展】羊棲菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化[2-4]、增強免疫活性[5-6]等功能。目前羊棲菜多糖提取純化技術(shù)已在多個實驗室進行，通過水提醇沉方法提取羊棲菜粗多糖，純化后測定其含量高達45%～65%(文獻[7])。黑腹果蠅作為繁殖速度快，培養(yǎng)周期短的優(yōu)勢模式生物，可用于驗證羊棲菜多糖對動物羽化過程的影響。據(jù)報道，高濃度多糖可能對果蠅羽化過程存在一定的損傷作用[8]，提高培養(yǎng)基滲透壓，高糖情況下也會降低果蠅羽化率[9-11]。【本研究切入點】目前，國內(nèi)多個實驗室對羊棲菜多糖功能的研究主要集中在抗腫瘤、抗氧化和增強免疫活性等方面，而對其抗衰老活性的研究卻鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】提取成分穩(wěn)定的羊棲菜多糖，并研究其對黑腹果蠅生長的影響，為進一步探討羊棲菜多糖抗衰老作用的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

羊棲菜(Sargassum fusiforme)采自浙江省溫州市洞頭沿海海岸。

野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)由溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實驗室提供。

基本培養(yǎng)基：蔗糖26 g，瓊脂粉3 g，ddH2O 300 mL，玉米粉34 g，酵母粉1 g，丙酸2 mL。

果汁培養(yǎng)基：葡萄汁150 mL，ddH2O 50 mL，瓊脂粉4 g，丙酸2 mL。

儀器：1525高效液相色譜儀(Waters科技有限公司)，包括2487紫外可見光檢測器、717plus 自動進樣器及Breeze工作站；MS105DU電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江陰市保利科研器械有限公司)；Milli-Q超純水儀(MILLIPORE公司)；體視顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)。試劑：L-鼠李糖(L-Rha)和D-半乳糖醛酸(D-GalA)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；D-甘露糖(D-Man)和D-木糖(D-Xyl)購自中國藥品生物制品鑒定所；D-葡萄糖醛酸(D-GlcA，SIGMA 公司)；D-葡萄糖(D-Glc，TCI 公司)；D-半乳糖(D-Gal)和L-阿拉伯糖(L-Ara)購自Dr Ehrenstorfer GmbH；L-巖藻糖(L-Fuc，F(xiàn)luka BioChemika 公司)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，ACROS 公司)；色譜純甲醇和乙腈(Honeywell Burdick& Jackson 公司)。其它試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1羊棲菜多糖的提取

參照文獻[12]，采摘新鮮羊棲菜，烘干至恒重，粉碎機粉碎后，篩網(wǎng)過濾，除去未粉碎雜質(zhì)。稱取粉末500 g，放入300 mL無水乙醇中，于旋蒸儀上80℃水浴回流3次，每次2 h。收集濾渣，加入15 L蒸餾水，85℃蒸煮3遍，時間依次為4 h，3 h，2 h。兩層紗布過濾，收集濾液，65℃旋蒸濃縮至5 L，離心收集上清液，繼續(xù)濃縮至總體積為3 L。濃縮液加入無水乙醇使含醇量達80%，醇沉過夜。收集醇沉上清液，4 800 r/min離心10 min。收集離心上清液，加入4 mol/L氯化鈣至不再產(chǎn)生沉淀為止，離心取上清液，80%乙醇(V/V)醇沉過夜，取沉淀進行常規(guī)干燥、真空干燥，得到羊棲菜多糖。

1.2.2總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定羊棲菜多糖總糖含量[13]。精確稱取分析純葡萄糖20 mg，用蒸餾水定容至500 mL，分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，各補水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 6%(V/V)的苯酚溶液，振蕩。再加入5.0 mL濃硫酸，迅速振蕩搖勻，置于沸水浴中加熱15 min后冷卻，于波長490 nm下測定吸光值。以水做空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取羊棲菜多糖樣品5 mg，加少量熱水溶解后定容至100 mL。精確量取1.0 mL，按上述步驟操作，測定其吸光值，試驗重復(fù)3次。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.2.3糖醛酸含量測定

采用間羥基聯(lián)苯法測定羊棲菜多糖中的糖醛酸含量[14]。稱取10 mg D-半乳糖醛酸，溶解于蒸餾水中，并定容到100 mL容量瓶中，搖勻備用。移液器分別量取0.1 g/L D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL轉(zhuǎn)于玻璃試管中，加蒸餾水補至400 μL，每個濃度3個重復(fù)。向每支試管中加入氨基磺酸試劑40 μL，搖勻，再向各管加入濃硫酸2.5 mL，振蕩均勻，沸水浴煮沸20 min。冷卻至室溫后，向各管中加入間羥基聯(lián)苯試劑40 μL，搖勻，室溫放置15 min。在λ=525 nm處測定吸光度A。以吸收度A為縱坐標(biāo)，D-半乳糖醛含量(μg)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取濃度0.1 g/L左右的樣品溶液400 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計算其中的糖醛酸含量。

1.2.4蛋白含量測定

采用Bradford法羊棲菜多糖中的測定蛋白質(zhì)含量。精確稱取0.1 g牛血清蛋白(BSA)，配置成10 mg/mL的BSA母液10 mL。分別吸取0.10 mL、0.08 mL、0.06 mL、0.04 mL、0.02 mL、0.00 mL，各補水至1.0 mL，然后在不同倍數(shù)稀釋液中各自吸取0.1 mL，補水至1.0 mL。配置成終濃度為0.10 mg/mL、0.08 mg/mL、0.06 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.00 mg/mL的稀釋液。各吸取20 μL于96孔板中，每組3個平行，每孔加入200 μL考馬斯亮藍(G-250)，靜置10 min，酶標(biāo)儀測定595 nm下吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取羊棲菜多糖樣品5 mg，加少量熱水溶解后定容至100 mL。精確量取1.0 mL，按上述步驟操作，測定其吸光值，試驗重復(fù)3次。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.2.5羊棲菜多糖分子量測定

準(zhǔn)確稱取無水硫酸鈉14.204 g，ddH2O溶解，并完全轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，定容，搖勻備用。準(zhǔn)確稱取分子量分別為2 000 000,133 800,84 400,21 400,7 100和180的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶于1 mL 0.1 mol/L硫酸鈉中，用0.22 μL過濾膜過濾，所得即為待測標(biāo)準(zhǔn)樣品。準(zhǔn)確稱取已純化的樣品各5 mg溶于1 mL 0.1 mol/L硫酸鈉中，10 000 r/min離心后用0.22 μL過濾膜過濾，所得即為待測樣品。樣品采用HPLC測定[15]，通過HPLC中標(biāo)準(zhǔn)樣品的洗脫時間和相對分子質(zhì)量等數(shù)據(jù)計算，獲得分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過洗脫時間或洗脫體積計算出各組分分配系數(shù)(Kav)，然后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出羊棲菜多糖的分子量對數(shù)并轉(zhuǎn)換成分子量。

1.2.6單糖含量測定

稱取羊棲菜多糖樣品4 mg，加入2 mol/L三氟乙酸，120℃水解1 h，加入少量乙醇，45℃水浴干燥，重復(fù)3～5次，完全蒸除三氟乙酸。向完全酸水解后獲得的干燥樣品中加入0.5 mL PMP試劑和0.5 mL 0.3 mol/L的NaOH溶液，待樣品充分溶解后取0.1 mL于離心管中，70℃水浴30 min。10 000 r/min離心5 min后，加入0.05 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液和0.05 mL蒸餾水，充分混勻。加入1 mL氯仿，混勻后抽提剩余的PMP試劑，吸去氯仿層，保留水層。用0.22 μm濾膜過濾后，加入適量蒸餾水稀釋，待HPLC檢測。色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS-3(4.6 mm×250 mm)，流動相為83.0% (V/V)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，0.1 mol/L,pH值為6.9)和17.0%乙腈(V/V)，流速為0.8 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為254 nm。以標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-木糖(D-Xyl)、D-甘露糖(D-Man)、L-巖藻糖(L-Fuc)、D-半乳糖醛酸(D-Gal A)、D-葡萄糖醛酸(D-Glc A)進行對照[12]。

1.2.7羊棲菜多糖濃度對黑腹果蠅形態(tài)的影響

收集在基本培養(yǎng)基中8 h內(nèi)新羽化的黑腹果蠅，雌雄分開，隨機分為8組(每組為100只雌性或雄性黑腹果蠅)。其中，兩個對照組(CK♀和CK♂)加入不含羊棲菜多糖的基本培養(yǎng)基，其余6組(實驗組0.1%♀、0.5%♀、1.5%♀、0.1%♂、0.5%♂、1.5%♂)分別加入濃度為0.1%，0.5%，1.5%的羊棲菜多糖(每100 mL培養(yǎng)基中所含有的羊棲菜多糖的克數(shù))的基本培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個平行組。培養(yǎng)箱中每3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后，體視顯微鏡觀察體型變化，分析天平稱取體重(每15只黑腹果蠅為一組)并分析其變化。1.2.8羊棲菜多糖對黑腹果蠅幼蟲羽化的影響

隨機選取10瓶(約1 000只)黑腹果蠅，放入孵化箱，隨機交配。配置果汁培養(yǎng)基，收集黑腹果蠅卵。用PBS清洗黑腹果蠅卵，按照每瓶0.5 g黑腹果蠅卵(濕重)接種于對照組和實驗組培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3個平行。20 d內(nèi)觀察黑腹果蠅卵羽化情況，包括結(jié)蛹數(shù)量，羽化雌雄比例，總羽化天數(shù)，總羽化量以及F1黑腹果蠅羽化3 d后成蟲體重變化情況。

1.2.9數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件處理，以x±s表示，各組均數(shù)間差異采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有顯著性，P<0.01表示差異有極顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1羊棲菜多糖得率及純度

本試驗從500 g羊棲菜粉末中提取多糖，干燥后多糖凈重26.57 g，羊棲菜多糖提取率為5.31%。總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量回歸方程分別為Y=6.7596X-0.0023，R2=0.9990；Y=3.5272X+0.002，R2=0.9987；Y=0.01134X-0.00241，R2=0.9908。在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，5 mg/L的多糖濃度與吸光值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度值代入方程，計算出羊棲菜多糖中總糖含量較高，達81.93%；糖醛酸含量較低，僅為4.27%，表明熱提羊棲菜多糖為酸性多糖；蛋白質(zhì)含量較低，僅為3.81%，羊棲菜多糖中的蛋白質(zhì)可能不是游離蛋白質(zhì)，而是與多糖結(jié)合的糖蛋白。這說明所提取的羊棲菜多糖純度相對較高。

2.2羊棲菜多糖分子量及單糖組成

分子量回歸方程為Y=-0.3160X+2.0196，R2=0.9967，分子量計算結(jié)果見表1。由圖1a可看出9種單糖分離度相對較高，圖1b是羊棲菜多糖分離結(jié)果，與9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照以確定其單糖組成，其結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過熱提醇沉法提取到的羊棲菜多糖有較穩(wěn)定的分子量和單糖組成。

圖1單糖標(biāo)準(zhǔn)品及熱提羊棲菜多糖HPLC分析
Fig.1Standard monosaccharides and the analysis of SFPs by HPLC

2.3羊棲菜多糖對黑腹果蠅形態(tài)的影響

與對照組(CK)相比，添加羊棲菜多糖的實驗組中，黑腹果蠅在體型和體重上都偏大(圖2和圖3)。其中，雌黑腹果蠅(♀)以0.5%♀和1.5%♀兩組的體型增大更加顯著，經(jīng)過多重比較發(fā)現(xiàn)，0.1%♀和1.5%♀組與對照組存在顯著差異，0.5%♀組與對照組存在極顯著差異；雄黑腹果蠅(♂)以1.5%♂組體型和體重變化最明顯，多重比較發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組存在顯著差異，但實驗組之間沒有顯著差異。

表1羊棲菜多糖的分子量及單糖組成

Table 1The molecular weight and monosaccharide composition of polysaccharides from Sargassum fusiforme

樣品Sample分子量Molecularweight(Da)單糖組成Monosaccharidecomposition(%)Mw1Mw2Mw3DManLRhaDGlcADGalADGlcDGalDXylLAraLFucSFPs12.4×1055.26×1045.8×1033.451.751.012.5511.0311.5012.00—49.98SFPs22.3×1055.29×1045.9×1033.521.790.912.8911.4511.5912.34—54.23SFPs32.5×1055.25×1045.9×1033.531.771.402.3911.5011.4411.96—54.46均值Mean2.4×1055.27×1045.9×1033.501.771.112.6111.3311.5112.10—52.89

圖2羊棲菜多糖對黑腹果蠅體型的影響

Fig.2The effects of polysaccharides on size of Drosophila melanogaster

圖3羊棲菜多糖對黑腹果蠅體重的影響

Fig.3The effects of polysaccharides on weight of Drosophila melanogaster

2.4羊棲菜多糖對黑腹果蠅羽化過程的影響

由圖4可知，實驗組黑腹果蠅幼蟲結(jié)繭時間都相較長于對照組，且數(shù)量上也比較少。對照組和實驗組在幼蟲孵化率上存在明顯差異，實驗組在同一時期的幼蟲數(shù)量隨濃度升高呈下降趨勢，即羊棲菜多糖濃度越高，幼蟲數(shù)量越少，結(jié)繭數(shù)量也隨之下降。由圖5可知，隨著羊棲菜多糖濃度增加，黑腹果蠅羽化時間逐漸延長，對照組黑腹果蠅從卵至羽化高峰為5～8 d，0.1%和0.5%組為6～9 d，1.5%組為6～10 d，且經(jīng)羊棲菜多糖處理的實驗組相較于對照組，其首只子代黑腹果蠅孵育時間推遲約3 d。

圖4羊棲菜多糖對黑腹果蠅幼蟲羽化過程的影響

Fig.4The effects of polysaccharides on larval emergence process

圖5羊棲菜多糖對F1代黑腹果蠅幼蟲羽化時間的影響

Fig.5The effects of polysaccharides on emergence time for F1 generation

2.5羊棲菜多糖對黑腹果蠅羽化結(jié)果的影響

表2結(jié)果表明， 實驗組0.1%♀和1.5%♀與CK♀組相比，羽化數(shù)量存在顯著差異，0.5%♀組也較CK♀組略有下降；與CK♂組相比，0.1%♂組羽化數(shù)量顯著下降，0.5%♂和1.5%♂組則下降不明顯。對比羽化成蟲雌雄比例，0.5%組最高(1.34)，1.5%組最低(1.02)，與CK組存在顯著差異。可見，經(jīng)過羊棲菜多糖處理后黑腹果蠅的羽化數(shù)量減少，其性別比例也受到一定影響。

由圖6可知，0.5%組黑腹果蠅體重最重，15只

表2羊棲菜多糖對黑腹果蠅羽化結(jié)果的影響(x±s)

Table 2The effects of polysaccharides from Sargassum fusiforme on emergency in Drosophila melanogaster(x±s)

組別Group多糖濃度Concentration(%)羽化雌蠅(只)Femalequantity(No.)羽化雄蠅(只)Malequantity(No.)雌雄比例Sexratio羽化總數(shù)(只)Total(No.)CK0636.00±33.05511.67±11.021.24±0.081147.67±28.02EXP0.1490.67±62.31*428.33±15.18*1.15±0.16919.00±60.51*0.5595.67±13.31466.33±19.221.34±0.071042.00±20.781.5482.00±21.93*474.33±22.591.02±0.01*956.33±44.06*

注：與CK組相比，*P<0.05，存在顯著差異

Note:Compared with CK group,*P<0.05,significantly different

黑腹果蠅平均值高達10.50 mg(♀)和9.10mg(♂)，0.1%和1.5%組黑腹果蠅體重也相應(yīng)增加，與CK組相比，均存在顯著差異。

圖6羊棲菜多糖對羽化黑腹果蠅體重的影響

Fig.6The effects of polysaccharides on weight of Drosophila melanogaster

3　結(jié)論

本研究采用熱提醇沉方法得到性質(zhì)穩(wěn)定的羊棲菜多糖，并以黑腹果蠅為模式生物，研究羊棲菜多糖對其生長的影響。結(jié)果表明，羊棲菜多糖能明顯增加黑腹果蠅的體型和體重，并且隨著羊棲菜多糖濃度的升高，黑腹果蠅體型和體重也隨之增加；推遲羽化時間，對羽化率有一定損害；對黑腹果蠅后代個體中雌雄性別的比例有一定影響。

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(責(zé)任編輯：陸雁)

Effects of Polysaccharides from Sargassum fusiforme on Growth of Drosophila melanogaster

ZHANG Ya，XIAO Baoheng，WU Mingjiang

(School of Life and Environmental Science，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang，325035，China)

【Objective】The effects of different concentrations of Sargassum fusiforme polysaccarides (SFPs) extracted by heat extraction and alcohol precipitation on growth of Drosophila melanogaster were investigated.【Methods】The SFPs were extracted through 85℃ hot boiled extract,ethanol precipitation,calcium chloride to remove impurities and other processes.The effects on larval emergence，weight and body size of Drosophila melanogaster were explored in different concentrations of the SFPs in the media.【Results】The SFPs obtained by heat extraction and alcohol precipitation had high purity，total sugar content as high as 81.93%，molecular weight and monosaccharide composition revealed more stable.Drosophila melanogaster increased in size and weight after treatment with SFPs.Compared with the control group,There was statistical difference in 0.1%♀ and 1.5%♀ groups(P<0.05) and there was significantly different between 0.5%♀ and control group;The experimental groups of 0.1% ♂,0.5% ♂ and 1.5% ♂ revaeled significant differences with the control group,but no significant difference between them,of which weight gain was most evident in 1.5%♂ group.There were significant differences in the larvae hatching between experimental group and control group;The phase from egg to feathering was 5～8 d in control group, 6～9 d in both 0.1% and 0.5% groups,and 6～10 d in 1.5% group.There was a significant difference in emergence rate in 0.1%♀,1.5%♀ and 0.1%♂ groups compared with the corresponding control group.Considering the proportion of male and female adult emergence,only 1.5% group significantly differed with CK group.【Conclusion】The SFPs obtained by heat extraction and alcohol extraction are stable.They can reduce the larval emergence rate and prolong larval emergence time.They have a little effect on the proportion of male and female,and can increase the adult body and weight.

SFPs，Drosophila melanogaster，emergence rate，body size，weight

2016-04-10

張亞(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事糖生物學(xué)方面的研究。

R284.2

A

1005-9164(2016)03-0234-07

*國家自然科學(xué)基金項目(31470430，31200266，31070322)和溫州市海洋環(huán)境與生物資源技術(shù)創(chuàng)新團隊自主項目(C20120007-10)資助。

**通訊作者：吳明江(1963-)，男，教授，博士，主要從事糖生物學(xué)方面的研究，E-mail：wmj@wzu.edu.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(3):234～240

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-13【DOI】10.13656/j.cnki.gxkx.20160713.014

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160713.0859.028.html