黃桂媛，溫順華，李　鋒，盧明倩，王巧貞，廖　威,黃庶識**

(1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧　530007；2.廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建廈門　361003；3.黔南州民族師范學院化學化工學院，貴州都勻　558000;4.廣西職業(yè)技術(shù)學院，廣西南寧　530226)

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Shewanella haliotis BP-1海藻酸裂解酶基因的克隆表達*

黃桂媛1，溫順華2，李鋒3，盧明倩1，王巧貞1，廖威4,黃庶識1**

(1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧530007；2.廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，福建廈門361003；3.黔南州民族師范學院化學化工學院，貴州都勻558000;4.廣西職業(yè)技術(shù)學院，廣西南寧530226)

【目的】了解海洋細菌Shewanella haliotis BP-1中海藻酸裂解酶降解海藻酸鈉的生物活性?！痉椒ā繎?yīng)用基因克隆和大腸桿菌異源表達技術(shù)，過量表達海藻酸裂解酶，將粗酶液通過DEAE Sepharose FF柱分離純化后檢測其酶活性?！窘Y(jié)果】從S.haliotis BP-1菌株的基因組DNA中克隆得到一個大小為2 157 bp的海藻酸裂解酶基因Alg17S，該基因編碼的海藻酸裂解酶Alg17S屬于PL17家族的蛋白，大小為79 726 Da，其中包括N端26個氨基酸的信號肽，與Saccharophagus degradans 2-40菌株產(chǎn)生的海藻酸裂解酶Alg17C具有高度同源性，相似性為52%。經(jīng)純化后獲得的重組酶Alg17S和△snAlg17S(N端不含26個氨基酸的信號肽)均具有降解海藻酸鈉的活性，但△snAlg17S對海藻酸鈉的催化活性比Alg17S高，其酶比活力高達9 635 U/mg?！窘Y(jié)論】重組海藻酸裂解酶△snAlg17S兼具高表達水平及高酶活性，是進一步研究海藻酸鹽糖化和生物燃料生產(chǎn)的潛在的優(yōu)勢酶。

海藻酸裂解酶克隆表達酶活性測定Shewanella haliotis BP-1

0　引言

【研究意義】海藻酸具有在水介質(zhì)中形成粘性溶液和凝膠的能力以及對生物無毒性的特點，在醫(yī)藥、化妝品、食品和生物技術(shù)等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[1]。同時海藻酸的降解產(chǎn)物褐藻寡糖具有廣泛的生物活性，如促進植物生長、緩解植物非生物脅迫、抗腫瘤、抑菌、抗凝血、降血糖血脂、抗自由基氧化、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)活性等作用，在綠色農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健、食品、日用化工等領(lǐng)域具有廣闊的前景[2]?！厩叭搜芯窟M展】目前已有很多關(guān)于產(chǎn)海藻酸裂解酶細菌的報道，例如Pseudomonas sp.，Azotobacter sp.，Alteromonas sp.，Vibrio sp.，Sphingomonas sp.，F(xiàn)lavobacterum sp.等[3]。大多數(shù)細菌海藻酸裂解酶通常是分泌到細胞周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基即細胞外降解海藻酸的，但也有部分如Sphingomonas sp.A1菌株對海藻酸的降解作用發(fā)生在細胞質(zhì)中，菌株A1在ABC轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)作下將高分子海藻酸攝入細胞質(zhì)中，然后進一步分解[3-7]。另外，在Carbohydrate-Active enZYmes(CAZY)數(shù)據(jù)庫中登記的細菌海藻酸裂解酶基因已經(jīng)超過500個[8]。1993年，Boyd等[9]首次克隆了假單胞菌(Pseudomonas alginovora)海藻酸裂解酶編碼基因algL，并在大腸桿菌中成功表達，粗酶比活力為146 U/mg，是原始野生菌株的2.5倍；Uchimura等[10]從Vibrio sp.JAM-Aam菌株中克隆得到海藻酸裂解酶編碼基因A9mT，并使其在大腸桿菌DH5α中分泌表達，從發(fā)酵液中分離純化得到A9mT蛋白酶的生物活性高達1 401 U/mg；Li等[11]從Agarivorans sp.L11菌株中克隆到一個新的編碼海藻酸裂解酶基因AlyL1，該基因在大腸桿菌中的重組表達蛋白AlyL1具有高的生物催化活性，比活力為1 370 U/mg。目前，已經(jīng)有20多種海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，其中大部分基因已成功地進行了異源表達[12]?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗室從北部灣海域分離篩選出一株Shewanella haliotis BP-1菌株(菌株BP-1)，在該菌株的發(fā)酵液中分離純化得到1種酶，該酶經(jīng)基本的酶學性質(zhì)分析，確定是外分泌的海藻酸裂解酶，分子量約為70 kDa，同時具有降解poly(M)和poly(G)的活性，酶的比活力高達40 420 U/mg(文獻[13])。本研究在菌株BP-1的基因組注釋結(jié)果中找出一個可能編碼海藻酸裂解酶的基因Alg17S，并對其進行克隆表達以及重組酶的活性檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】驗證重組酶Alg17S具有降解海藻酸的生物活性，為闡明BP-1菌株利用海藻酸鈉的代謝途徑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

海洋細菌菌株Shewanella haliotis BP-1從廣西北海潿州島采集到的腐爛馬尾藻中篩選獲得；實驗所使用的細菌表達載體pET-11d、pET-27b購自上海捷瑞生物工程有限公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；大腸桿菌Trans5α、BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2酶與試劑

DNA聚合酶，DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自博日科技(Bioflux)公司；海藻酸鈉為阿拉丁?(Aladdin?)品牌試劑，其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑；所得樣品送往TaKaRa公司測序。

1.3培養(yǎng)基和抗生素

LB液體培養(yǎng)基(W/V)：1%Tryptone、0.5% Yeast Extract和1% NaCl?？股匕逼S青霉素(Ampicillin，Amp)，貯液濃度100 mg/mL，終濃度50 μg/mL；抗生素卡那霉素(Kanamycin，Ka)，貯液濃度50 mg/mL，終濃度25 μg/mL；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)貯液濃度100 mmol/L，終濃度0.4 mmol/L。配制LB固體培養(yǎng)基時加入1.5%(W/V)的瓊脂，抗生素則為液體培養(yǎng)基使用濃度的兩倍。

1.4引物設(shè)計

根據(jù)菌株BP-1全基因組注釋結(jié)果中可能編碼海藻酸裂解酶基因的核酸序列，利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計兩對PCR引物，Alg17S-F和Alg17S-R用于擴增海藻酸裂解酶完整的基因編碼序列，△snAlg17S-F和△snAlg17S-R用于擴增不含信號肽的海藻酸裂解酶的基因編碼序列。設(shè)計引物時分別在上游引物的5′端添加BspHⅠ酶切位點，下游引物的5′端添加BamHⅠ酶切位點，引物序列如下，酶切位點用下劃線標出。

Alg17S-F：5′-GCGACTCATGAAAATACGATCCT-3′

Alg17S-R：5′-CGGGATCCGAATGTTCAGTCTT-3′

△snAlg17S-F：5′-GTTCATCATGAGCCCGTCA-

CTG-3′

△snAlg17S-R：5′-CGGGATCCGAATGTTCAGT-

CTT-3′

1.5基因組DNA的制備

菌株BP-1全基因組DNA的提取參照BioSpin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit 說明書。用0.8%(W/V)的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA的大小?；蚪MDNA的濃度和純度用Nanodrop法檢測。

1.6海藻酸裂解酶基因的克隆與分析

以菌株BP-1基因組DNA為模板，利用Ex Taq DNA聚合酶PCR 擴增獲得目的基因片段。PCR擴增程序：94℃預變性5 min;94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。海藻酸裂解酶基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后與TA克隆質(zhì)粒pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，提取陽性克隆的質(zhì)粒送測序。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)數(shù)據(jù)庫在線分析基因的開放閱讀框；使用軟件DNASIS MAX Trial V3.0推導海藻酸裂解酶基因編碼蛋白的氨基酸序列；通過Signalp-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測分析海藻酸裂解酶的信號肽；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具計算蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量和理論等電點；依據(jù)蛋白質(zhì)多序列比對的結(jié)果，采用MEGA 5.1構(gòu)建Alg17S蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.7海藻酸裂解酶基因的表達與純化

將測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-Alg17S，pMD18-T-△snAlg17S和細菌表達載體pET-11d,pET-27b分別進行BspHⅠ和BamHⅠ酶切，酶切產(chǎn)物回收、連接構(gòu)建得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒pET-11d-Alg17S，pET-27b-△snAlg17S。陽性克隆子送TaKaRa公司測序。

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-11d-Alg17S，pET-27b-△snAlg17S轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種至10 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。按接種量為1%(V/V)將菌液接種至100 mL

加有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8，向菌液中加入0.4 mL 100 mmol/L的IPTG使其終濃度為0.4 mmol/L，并將菌液轉(zhuǎn)入20℃，200 r/min搖床誘導培養(yǎng)24 h。

蛋白分離純化實驗均在4℃下進行。將100 mL誘導菌液6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用20 mmol/L，pH值7.5的磷酸緩沖液重懸后超聲波細胞粉碎機裂解菌體；裂解的菌液經(jīng)8 000 r/min，離心30 min后收集的上清液，即海藻酶裂解酶的粗酶液。蛋白粗酶液依次經(jīng)過DEAE Sepharose FF柱(上海楷洋)和蛋白質(zhì)截留分子量為10 kDa的超濾離心管(Millpore)進行分離純化與濃縮。12% SDS-PAGE電泳分析蛋白純化結(jié)果，Bradford方法[14]檢測純化的蛋白質(zhì)濃度。

1.8海藻酸裂解酶活力定性測定

將獲得的海藻酸裂解酶粗酶液點種于含0.2%(W/V)海藻酸鈉的LB固體培養(yǎng)基上，37℃放置30 min，最后使用10%(W/V)氯代十六烷吡啶染色，觀察重組酶Alg17S，△snAlg17S水解海藻酸鈉透明圈產(chǎn)生的情況，同時以含有空載體的pET-11d/BL21(DE3)和pET-27b/BL21(DE3)重組菌作為陰性對照。

1.9海藻酸裂解酶活力定量測定

酶活性的測定參照Preiss方法[15]。取 0.1%(W/V)的海藻酸鈉溶液(0.1 g海藻酸鈉溶于100 mL ，pH 值7.5，0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液)2 mL，加入0.5 mL酶液，37℃水浴30 min后,沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫后測定反應(yīng)體系在235 nm處的光吸收值。在此條件下，每分鐘光吸收值增加0.001定義為一個酶活力單位(U)。

2　結(jié)果與分析

2.1編碼海藻酸裂解酶基因序列分析與克隆

菌株BP-1全基因組中僅存在一個可能編碼海藻酸裂解酶的基因Alg17S， 核酸序列見圖1。 分析結(jié)果顯示，該基因包含一個大小為2 157 bp的開放閱讀框，編碼含718個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)海藻酸裂解酶Alg17S， 其理論分子量和理論等電點(pI)分別為79 726 Da和5.72，其中N端信號肽大小為26個氨基酸(圖1下劃線標出)。在CAZY數(shù)據(jù)庫中，海藻酸裂解酶被歸入多糖裂解酶(polysaccharide lyase，PL)蛋白家族[16]。NCBI在線分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，Alg17S蛋白與其他PL-17家族的蛋白一樣存在兩個保守的蛋白結(jié)構(gòu)域：一個是蛋白質(zhì)N端的海藻酸裂解酶超級家族結(jié)構(gòu)域；一個是蛋白質(zhì)C端的肝素酶(heparinas)Ⅱ/Ⅲ家族蛋白域[17]。同時，蛋白質(zhì)多序列比對分析表明Alg17S蛋白存在PL17家族蛋白保守的2個可能的催化位點Y235和Y445(絡(luò)氨酸 Try，Y)和3個底物相互作用位點D420(天冬氨酸Asp，D)、H410和H459(組氨酸His，H)[17]。如圖2所示，Alg17S與S.degradans 2-40的海藻酸裂解酶Alg17C的進化距離最近，氨基酸序列的相似性為52%。

Y為Alg17S假定的催化位點；H、D為假定的底物相互作用位點

Y indicates the proposed catalytic sites;H and D substrate interacting sites for Alg17S

圖1S.haliotis BP-1海藻酸裂解酶基因的核酸序列和推導的氨基酸序列

Fig.1Nucleotide and deduced amino acid sequence of the alginate lyase gene from S.haliotis BP-1

圖2Alg17S與其它PL17家族蛋白的系統(tǒng)進化樹

Fig.2Phylogenetic tree of Alg17S and other PL17 family

以菌株BP-1的基因組DNA為模板，使用引物Alg17S-F/Alg17S-R和△snAlg17S-F/△snAlg17S-R進行PCR擴增，分別得到大小為2 157 bp和2 085 bp的DNA片段(圖3)。TA克隆、測序結(jié)果表明，Alg17S核酸序列和△snAlg17S核酸序列分別與全基因組中可能編碼海藻酸裂解酶的核酸序列和去掉信號肽的海藻酸裂解酶的序列相似性均為100%。

2.2海藻酸裂解酶基因表達及酶活力的定性測定

成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-11d-Alg17S和pET-27b-△snAlg17S在大腸桿菌BL21(DE3)中表達并獲得海藻酸裂解酶粗酶，該酶的大小約為70 kDa，與溫順華[13]從原始菌株BP-1中分離純化得到的海藻酸裂解酶的大小相近。如圖4a～b所示,重組菌pET-11d-Alg17S/BL21(DE3)和pET-27b-△snAlg17S/BL21(DE3)的粗酶液在含海藻酸鈉的LB固體平板上都可以產(chǎn)生透明圈，說明BP-1菌株的海藻酸裂解酶無論有無信號肽都可以成功表達具有活性的蛋白酶；但是△snAlg17S蛋白水解海藻酸鈉形成的透明圈亮度明顯要比Alg17S的亮，這可能是前者重組酶的比活力要比后者高得多。同時pET-11d/BL21(DE3)(圖4c)和pET-27b/BL21(DE3)(圖4d)陰性對照組均沒有透明圈生成。

1：含信號肽的海藻酸裂解酶基因的PCR產(chǎn)物；2：不含信號肽的海藻酸裂解酶基因的PCR產(chǎn)物；M：1 kb DNA ladder

1：The PCR products of alginate lyase gene containing signal peptide；2：Alginate lyase gene PCR products without the signal peptide；M：1 kb DNA ladder

圖3菌株BP-1海藻酸裂解酶基因PCR產(chǎn)物

Fig.3The alginate lyase gene PCR products from BP-1 strain

(a)pET-11d-Alg17S/BL21(DE3);(b)pET-27b-△snAlg17S/BL21(DE3);(c)pET-11d/BL21(DE3);(d)pET-27b/BL21(DE3)

圖4重組菌產(chǎn)海藻酸裂解酶活性的定性測定

Fig.4Detection of alginate lyase activities of recombinant strain

2.3海藻酸裂解酶的純化及酶活力的定量測定

如圖5所示，純化的蛋白酶分子量與從S.haliotis BP-1菌株中分離純化得到的酶蛋白一樣約為70 kDa。由表1可見，不含信號肽的海藻酸裂解酶△snAlg17S活性要比含信號肽的Alg17S高，或許信號肽的存在影響了蛋白酶的高級結(jié)構(gòu)從而影響了酶對底物的結(jié)合催化活性?！鱯nAlg17S純蛋白比初始粗酶液純化了30.3倍，酶的比活力高達9 635 U/mg，約為Alg17S的4.7倍，但是無論是△snAlg17S還是Alg17S，它們對海藻酸鈉降解的最大酶比活力都遠遠高于Agrobacterium tumefaciens C58的AtU3025(20.5 U/mg)、Sphingomonas sp.A1的A1-IV(17.2 U/mg)和Pseudomonas sp.QD3的海藻酸裂解酶(173.4 U/mg)[18-19]，這些結(jié)果表明菌株BP-1的海藻酸裂解酶對海藻酸鈉具有更高的親和力與更有效的水解能力。

M：molecular weight markers；1：purified Alg17S；2：purified △snAlg17S

圖5重組酶Alg17S、△snAlg17S的SDS-PAGE電泳

Fig.5SDS-PAGE of Alg17S and △snAlg17S

表1純化的重組酶Alg17S和△snAlg17S的活性定量測定

Table 1The activity quantitative determination of purified recombinant enzyme Alg17S and △ snAlg17S

項目Item總蛋白Totalprotein(mg)總活力Totalactivity(U)比活力Specificactivity(U/mg)產(chǎn)量Yield(%)純化倍數(shù)Purification(Fold)Alg17S粗酶液CrudeenzymesofAlg17S36.910670289100.01.0純化的Alg17SPurificationofAlg17S0.241220603.97.1△snAlg17S粗酶液Crudeenzymesof△snAlg17S57.718331318100.01.0純化的△snAlg17SPurificationof△snAlg17S0.21921963510.530.3

3　結(jié)論

從海洋細菌菌株S.haliotis BP-1中成功克隆的目的基因Alg17S、△snAlg17S的核酸序列和從其全基因組注釋結(jié)果中找出的可能編碼海藻酸裂解酶的核酸序列相似性為100%。海藻酸裂解酶歸屬于多糖裂解酶家族的PL17家族，分子量為79 726 Da。表達的海藻酸裂解酶重組蛋白Alg17S和△snAlg17S可以有效的水解海藻酸鈉，且后者的水解能力明顯高于前者。△snAlg17S具有較高的海藻酸降解酶活性，酶的比活力高達9 635 U/mg，約為Alg17S的4.7倍，為進一步研究海藻酸鹽糖化和生物燃料的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]HERNANDEZ-CARMONA G,MCHUGH D J,LOP-EZ-GUTIERREZ F.Pilot plant scale extraction of laginates from Macrocystis pyrifera[J].Apppl Phycol,2000,11:493-502.

[2]劉航,尹恒,張運紅,等.褐藻膠寡糖生物活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012(S1):201-204.

LIU H,YIN H,ZHANG Y H,et al.Research progress on biological activities of alginate oligosaccharides[J].Nat Prod Res Dev,2012(S1):201-204.

[3]WONG T Y,PRESTON L A,SCHILLER N L.Alginate lyase:Review of major sources and enzyme characteristics,structure-function analysis,biological roles,and applications[J].Annual Review of Microbiology,2000,54:289-340.

[4]MURATA K,INOSE T,HISANO T,et al.Bacterial alginate lyase:Enzymology,genetics and application[J].Journal of Fermentation & Bioengineering,1993,76(93):427-437.

[5]TOMOO S,MIWA O,YOSHIO E.Novel alginate lyases from marine bacterium Alteromonas sp.strain H-4[J].Carbohydrate Research,1997,304(1):69-76.

[6]ZHEN Q Z,GUANG L Y,HUA S G,et al.Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibro sp.510[J].Carbohydrate Research,2004,339(8):1475-1481.

[7]HUANG L,ZHOU J,XIAO L,et al.Characterization of a new alginate lyase from newly isolated Flavobacterium sp.S20[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2013,40(1):113-122.

[8]HENRISSAT B,COUTINHO P M,LEVASSEUR A,et al.CAZY Carbohydrate-Active Enzymes Database[EB/OL].[2014-04-15].http://www.cazy.org.

[9]SCHILLER N L,MONDAY S R,BOYD C M,et al.

Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate lyase gene (algL):Cloning,sequencing,and expression in Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,1993,175(15):4780-4789.

[10]UCHIMURA K,MIYAZAKI M,NOGI Y,et al.Cloning and sequencing of alginate lyase genes from deep-sea strains of Vibrio and Agarivorans and characterization of a new Vibrio enzyme[J].Marine Biotechnology,2010,12(5):526-533.

[11]LI S,YANG X,ZHANG L,et al.Cloning,expression,and characterization of a cold-adapted and surfactant-stable alginate lyase from marine bacterium Agarivorans sp.L11[J].Journal of Microbiology & Biotechnology,2015,25(5):681-686.

[12]李鋒,溫順華,黃庶冰,等.響應(yīng)面法優(yōu)化海帶酸水解預處理工藝[J].可再生能源,2012,30(11):93-103.

LI F,WEN S H,HUANG S B,et al.Optimized pretreatmet process of acid hydrolysis Laminaria japonica by response surface methodology[J].Renewable Energy Resources,2012,30(11):93-103.

[13]溫順華.褐藻糖化預處理過程中褐藻膠裂解酶的作用研究[D].昆明：昆明理工大學，2013.

WEN S H.Study on Saccharification of Brown Algae by Alginate Lyase[D].Kunming： Kunming University of Science and Technology,2013.

[14]BRADFORD M M.A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(S1/S2):248-254.

[15]PREISS J,ASHWELL G.Alginic acid metabolism in bacteria.I.Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid[J].Journal of Biological Chemistry,1962,237(2):309-316.

[16]CANTAREL B L,COUTINHO P M,RANCUREE C,et al.The carbohydrate-active enzymes database (CAZY):An expert resource for glycogenomics[J].Nucleic Acids Research,2009,37(suppl 1):233-238.

[17]WANG L,LI S,YU W,et al.Cloning,overexpression and characterization of a new oligoalginate lyase from a marine bacterium,Shewanella sp.[J].Biotechnology Letters,2014,37(3):665-671.

[18]PARK H H,KAM N,LEE E Y,et al.Cloning and characterization of a novel oligoalginate lyase from a newly isolated bacterium Sphingomonas sp.MJ-3[J].Marine Biotechnology,2012,14(2):189-202.

[19]SAKATOKU A,TANAKA D,NAKAMURA S.Purification and characterization of an alkaliphilic alginate lyase AlgMytC from Saccharophagus sp.Myt-1[J].Journal of Microbiology & Biotechnology,2013,23(6):872-877.

(責任編輯：竺利波)

Gene Cloning and Expression of Alginate Lyase from Shewanella haliotis BP-1

HUANG Guiyuan1,WEN Shunhua2,LI Feng3,LU Mingqian1,WANG Qiaozhen1,LIAO Wei4,HUANG Shushi1

(1.Lab of Biophysics,Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China;2.Xiamen Innodx Biotech Co.Ltd.,Xiamen,Fujian,361003,China;3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Qiannan Normal College for Nationalities,Duyun,Guizhou,558000,China;4.Guangxi Vocational and Technical College，Nanning,Guangxi,530226,China)

【Objective】Alginate lyase in Shewanella haliotis BP-1 strains was studied illustrate its biological activity of degrading alginate.【Methods】The gene cloning technology and the Escherichia coli heterologous expression technology were applied to overexpress the alginate lyase;And the enzyme activity was analyzed after the crude enzyme was separated and purified by DEAE Sepharose FF chromatography.【Results】The alginate lyase gene Alg17S,with a size of 2 157 bp,was cloned from S.haliotis BP-1 strain genomic DNA and encoded an alginate lyase Alg17S,which belonged to polysaccharide lyase(PL)17 family and had a size of 79 726 Da protein(including an N-terminal signal peptide of 26 amino acid signal peptide).Alg17S showed high sequence identity of 52% with PL-17 protein sequence Alg17C from Saccharophagus degradans 2-40.Both the purified recombinase Alg17S and the △snAlg17S(without the N-terminal signal peptide of 26 amino acids)can degrade alginate,but the enzymatic activity of △snAlg17S revealed a specific activity of 9 635 U/mg,which was more efficient than Alg17S.【Conclusion】The recombinant alginate lyase △snAlg17S that has both high-level expression and high enzymatic activity could be a potential enzyme for further researching on the alginate saccharification and the biofuels production.

alginate lyase，cloning and expression，enzyme activity determination，Shewanella haliotis BP-1

2016-04-28

2016-06-17

黃桂媛(1986-)，女，研究實習員，主要從事分子生物學技術(shù)研究。

Q74

A

1005-9164(2016)03-0228-06

*國家自然科學基金項目(31560017)，廣西自然科學重點基金項目(2014GXNSFDA118012)和貴州省教育廳自然科學研究重點項目(黔教合KY[2014]286)資助。

**通訊作者：黃庶識(1964-)，男，研究員,主要從事應(yīng)用微生物學分子光譜研究,E-mail:hshushi@gxas.cn。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(3):228～233

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-13【DOI】10.13656/j.cnki.gxkx.20160713.003

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160713.0857.006.html