桂亞利　余鵬　張陽陽　涂飛　吳軍　劉莉　丁正年

?

·論著·

過度自噬介導心肌肥厚心功能不全

桂亞利余鵬張陽陽涂飛吳軍劉莉丁正年

目的研究自噬在心肌肥厚心功能不全中的作用。方法采用前期構(gòu)建的心肌肥厚心功能失代償?shù)臒嵝菘说鞍?7轉(zhuǎn)基因鼠(heat shock protein transgenic mice, Hsp27 Tg)模型 (4周齡、雌性),隨機分為(1)自噬抑制(WM)組:自噬抑制劑渥曼青霉素(wortmannin,WM)溶于DMSO溶劑,以1 mg/kg腹腔注射;(2)溶劑組:等體積的DMSO溶劑腹腔注射,連續(xù)3～7周齡。選取年齡、性別匹配的野生型對照鼠(wild type, WT)作為WT組。于注射WM前、后,測定心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值(heart weight/body weight, HW/BW),以二維超聲心動圖測定心功能,以免疫印跡方法測定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和p62水平以評價自噬水平。結(jié)果(1)與WT組相比,4周齡Hsp27 Tg鼠HW/BW顯著增加,而心臟射血分數(shù)(ejection fraction, EF%)和短軸縮短率(fraction shortening, FS%)均顯著下降(P<0.01);(2) 與WT組相比,4周齡Hsp27 Tg鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,而p62水平下降(P<0.01);(3)與溶劑組比較,注射3周后的WM組Hsp27 Tg鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平下降，而p62水平升高(P<0.01);(4)與溶劑組比較,WM注射3周Hsp27 Tg鼠的心臟EF%、FS%均顯著增加(P<0.01)。 結(jié)論WM通過抑制自噬水平改善Hsp27高表達誘導的病理性心肌肥厚心功能不全,提示過度自噬介導了心肌肥厚心功能不全的進展,為進一步探究心肌肥厚失代償階段的發(fā)病機制提供理論基礎。

心肌肥厚; 自噬; 渥曼青霉素

心肌肥厚是心臟對血流超負荷的一種代償反應,早期階段心肌細胞體積增大、肌節(jié)增多,心功能代償性增強,進一步發(fā)展為病理性心肌肥厚,心臟纖維化增加、心肌細胞能量代謝紊亂、心肌細胞壞死或凋亡,心功能失代償,最終轉(zhuǎn)化為心力衰竭(心衰)。病理性心肌肥厚作為心衰的前驅(qū)病變,是多種心血管疾病的獨立危險因子[1]。心肌組織內(nèi)ATP合成減少有效促進自噬活性升高,持續(xù)的自噬激活進一步加重線粒體損傷,從而導致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常[2]。但自噬在心肌肥厚失代償階段的作用尚有待闡明。本研究擬采用前期構(gòu)建的心肌肥厚心功能失代償?shù)臒嵝菘说鞍?7轉(zhuǎn)基因鼠(Hsp27 Tg)模型[3],觀察自噬抑制劑渥曼青霉素(wortmannin,WM)對心功能不全發(fā)生發(fā)展的影響,探索自噬在病理性心肌肥厚失代償階段中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑本實驗所用Hsp27 Tg雌鼠和性別匹配的同背景野生型(wild type,WT)鼠均由南京大學模式動物研究所提供,并飼養(yǎng)于模式所內(nèi)SPF級動物房。自噬相關(guān)蛋白LC3和p62單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和馬抗兔IgG購自美國Vector公司。

1.2分組和給藥方式將4周齡的Hsp27 Tg鼠分為2組:(1) WM組: WM先溶于DMSO,使用時用0.9% NaCl稀釋,每天早晨9點進行腹腔注射WM(1 mg/kg);(2) 溶劑組:取等體積DMS溶劑進行腹腔注射。連續(xù)給藥3周后斷頸處死動物后,迅速鑷取心臟置于冰的磷酸鹽緩沖液中,快速去除心腔中血液和心房,用干凈濾紙吸干水分后放置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3心肌肥厚檢測各組小鼠稱量體質(zhì)量后,迅速處死后直接取出心臟稱量心臟質(zhì)量并通過游標卡尺測定脛骨長度,然后計算各組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值(heat weight/body weight,HW/BW)。

1.4心功能檢測各組小鼠充分麻醉后,行常規(guī)超聲心動圖(VisualSonics Vevo770 超聲系統(tǒng))檢測。用刀片在各組小鼠胸前區(qū)備皮,麻醉后選擇小鼠心率維持>450次/min,以減少心率對射血分數(shù)(ejection fraction,EF)的影響。采用M型超聲心動圖像,每只小鼠至少檢測2次并連續(xù)采集5個心動周期的參數(shù),取均值用于統(tǒng)計比較。1.5Western blot檢測蛋白表達將-80 ℃保存心臟取出,加入400 μl組織裂解液,電動勻漿器以945 r/min勻漿3次,每次8 s。于4 ℃,24170 r/min,離心20 min后吸取上清。通過BCA法測定蛋白溶度[4],校正后在上清中加了緩沖液煮沸5 min。然后進行電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脫脂牛奶4 ℃孵育1 h后,分別加入LC3(1∶1000)、p62(1∶1000)一抗4 ℃過夜,次日用TBST(NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Tris base 3 g、加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4,加雙蒸水至1L,最后加入0.1%tween20)洗膜3次,每次10 min,室溫下加入相應二抗(1∶20000)孵育2～3 h;再用TBST洗膜3次,每次10 min,最后通過ECL顯影、曝光。利用AlphaEaseFc分析軟件測定條帶灰度值,并以內(nèi)參GAPDH進行對比標化。

2　結(jié)果

2.14周齡Hsp27 Tg鼠出現(xiàn)心肌肥厚4周齡的Hsp27 Tg鼠和WT小鼠心臟大體形態(tài)見圖1A,可見Hsp27 Tg鼠心臟體積顯著>WT鼠,經(jīng)過測定,Hsp27 Tg鼠HW/BW顯著高于WT鼠，增加了37.3%(P<0.01, 圖1B)。

注：與WT組比較,**P<0.01圖1　4周齡Hsp27Tg鼠表現(xiàn)心肌肥厚

2.24周齡Hsp27 Tg鼠出現(xiàn)心功能不全超聲心動圖測定4周齡小鼠的結(jié)果顯示:與WT組比較,心臟肥大的Hsp27 Tg鼠的EF%和FS%分別下降了14.9%、18.4% (P<0.01)。見圖2。

注：與WT組比較,**P<0.01圖2　心肌肥大的4周齡Hsp27Tg鼠表現(xiàn)心功能不全

2.3心肌肥大Hsp27 Tg鼠心肌組織中自噬水平升高4周齡WT和Hsp27 Tg組心肌Western blot檢測結(jié)果顯示:與WT組比較,Hsp27 Tg組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著上調(diào)了557.9%，p62蛋白水平降低了41.4% (P<0.01)。見圖3。

圖3　心肌肥大的4周齡Hsp27 Tg鼠心肌自噬被激活(n=4)

2.4WM抑制心肌肥大Hsp27 Tg鼠心肌組織中自噬水平與溶劑組比較,WM處理3周的Hsp27 Tg鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著下降了90.8%,p62蛋白水平升高了68.8% (P<0.01)。見圖4。

注：n=4/組圖4　WM抑制肥大心肌中的自噬激活(n=4)

2.5WM改善心肌肥大小鼠的心功能不全超聲心動圖檢測顯示:與溶劑組比較,WM組的EF%和FS%分別增加了 42.1%和51.8%(P<0.01), 見圖5。

注:與溶劑組比較,**P<0.01圖5　WM改善心肌肥大小鼠的心功能

3　討論

Hsp27是小分子熱休克蛋白家族的重要成員之一,已被證明是重要的心臟保護性分子伴侶[5-6]。我們早期研究發(fā)現(xiàn)在Hsp27中度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠可以有效抵抗內(nèi)毒素的心臟毒性,改善內(nèi)毒素血癥所致的心功能不全[7]。然而在心肌肥厚患者中發(fā)現(xiàn)心肌組織中Hsp27表達水平與心肌肥厚的進展呈正相關(guān),結(jié)合我們前期研究發(fā)現(xiàn)8周齡時Hsp27高表達的轉(zhuǎn)基因Tg10小鼠產(chǎn)生還原應激所致的病理性心肌肥厚,共同提示高表達的Hsp27可以促進心肌肥厚發(fā)生[3,8]。在本實驗中,我們觀察發(fā)現(xiàn)4周齡的Tg組小鼠已發(fā)生心肌肥厚和心功能不全。

自噬是細胞內(nèi)長壽蛋白質(zhì)和多種細胞器降解回收再利用的自主過程,而線粒體自噬則主要負責清除異常線粒體和線粒體相關(guān)蛋白。適當?shù)淖允?線粒體自噬活性對于維持心肌細胞的能量代謝穩(wěn)態(tài)是必不可少的[9]。然而,自噬/線粒體自噬的過度激活會通過非選擇性降解正常的線粒體和線粒體相關(guān)蛋白,進一步加重線粒體損傷和能量代謝障礙,形成能量紊亂的惡性循環(huán),最終引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的惡化。本研究發(fā)現(xiàn)心肌肥大小鼠心肌組織中LC3-Ⅱ增加而p62水平下降,提示自噬的過度激活可能在病理性心肌肥厚心功能不全中發(fā)揮作用。為了驗證上述假設,本研究選用已被廣泛驗證的自噬抑制劑WM應用于心肌肥厚。已有文獻報道,WM抑制Ⅲ型PI3K活性,是一種重要的自噬抑制劑。WM通過抑制自噬底物向溶酶體內(nèi)的運輸發(fā)揮抑制自噬的作用,并且具有很高的選擇性。通過連續(xù)3周的WM腹腔注射,我們發(fā)現(xiàn)WM雖然沒有逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的發(fā)生,但其有效抑制心肌組織內(nèi)自噬活性,改善心肌細胞和線粒體損傷并提高心肌能量代謝水平從而減輕病理性心肌肥厚的進一步發(fā)展。

綜上所述,WM能夠有效抑制Hsp27高表達所致病理性心肌肥厚模型中自噬活性,改善肥大性心臟的心功能不全,而阻止病理性心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)變,這為臨床延緩病理性心肌肥厚進展及心衰治療提供新靶點和新思路。然而,通過抑制自噬活性以達到保護線粒體和改善能量代謝的具體機制有待進一步實驗探討。

[1]Hughes SE. The pathology of hypertrophic cardiomyopathy[J]. Histopathology, 2004, 44(5): 412-427.

[2]Wohlgemuth SE, Calvani R, Marzetti E. The interplay between autophagy and mitochondrial dysfunction in oxidative stress-induced cardiac aging and pathology[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014, 71: 62-70.

[3]Zhang X, Min X, Li C, et al. Involvement of reductive stress in the cardiomyopathy in transgenic mice with cardiac-specific overexpression of heat shock protein 27[J]. Hypertension, 2010, 55(6): 1412-1417.

[4]Mizushima N, Yoshimori T, Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J]. Cell, 2010, 140(3): 313-326.

[5]Knowlton AA, Kapadia S, Torre-Amione G, et al. Differential expression of heat shock proteins in normal and failing human hearts[J]. J Mol Cell Cardiol, 1998, 30(4): 811-818.

[6]錢波,劉莉,閔笑顏, 等. 心肌特異性高表達熱休克蛋白27抑制阿霉素誘導的小鼠心肌凋亡[J]. 實用老年醫(yī)學, 2007, 21(3): 170-173.

[7]You W, Min X, Zhang X, et al. Cardiac-specific expression of heat shock protein 27 attenuated endotoxin-induced cardiac dysfunction and mortality in mice through a PI3K/Akt-dependent mechanism[J]. Shock, 2009, 32(1):108-117.

[8]余鵬,涂飛,張霞, 等. 熱休克蛋白27 心肌特異性高表達誘導小鼠產(chǎn)生心肌肥厚[J]. 實用老年醫(yī)學, 2014, 28 (6): 506-509.

[9]Nishida K, Kyoi S, Yamaguchi O, et al. The role of autophagy in the heart[J]. Cell Death Differ, 2009, 16(1): 31-38.

Excessive activation of autophagy mediates the development of cardiac dysfunction due to cardiac hypertrophy

GUIYa-li,DINGZheng-nian.DepartmentofAnesthesiology;YUPeng,ZHANGYang-yang,TUFei,WUJun,LIULi.

DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo investigate the role of autophagy in the progress of cardiac dysfunction due to cardiac hypertrophy.MethodsThe established pathological cardiac hypertrophy induced by high overexpression of Hsp27 in mice at the age of four weeks were divided into two groups: (1) vehicle-treated controls; (2) autophagy inhibition group: autophagy inhibitor Wortmannin (WM) was injected intraperitoneally (1 mg/kg) for three weeks. Age- and gender-matched wild type (WT) mice were chose as WT group. Heart weight to body weight ratio (HW/BW) were measured. Cardiac function was evaluated by two-D echocardiography. The autophagic flux was indicated by LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio and p62 protein degradation.Results(1) Compared with WT group, Hsp27 Tg mice showed an increased HW/BW ratio and declined cardiac ejection fraction (EF%) and fraction shortening (FS%) (P<0.01); (2) Compared with WT group, Hsp27 Tg mice exhibited an increased LC3-Ⅱ/LC3-I ratio and decreased p62 protein level (P<0.01); (3) Administration with WM for 3 weeks in Hsp27 Tg mice decreased LC3-Ⅱ/LC3-I ratio and increased p62 protein level, compared with vehicle-treated controls (P<0.01); (4) Administration with WM for 3 weeks increased EF% and FS% in Hsp27 Tg mice compared with vehicle-treated controls (P<0.01).ConclusionsWM improves cardiac dysfunction in mice with cardiac hypertrophy through inhibiting autophagy, which indicates the excessive activation of autophagy mediates the progress of cardiac dysfunction from cardiac hypertrophy. The data suggest that targeting of autophagy may serve as an alternative approach for the treatment of maladaptation of cardiac hypertrophy.

hypertrophy; autophagy; wortmannin

國家自然科學基金項目(81370260)

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科(桂亞利，丁正年)；老年心血管病科(余鵬，張陽陽，涂飛，吳軍，劉莉)

丁正年，Email: zhengnianding@njmu.edu.cn

R 542

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.05.006

2015-12-28)