張峰楊宏李慶堂殷英桃

GSK-3β蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及臨床意義

張峰①楊宏②李慶堂①殷英桃③

目的：檢測(cè)正常腦組織和不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中GSK-3β的表達(dá)以及其意義。方法：收集41例膠質(zhì)瘤和9例正常腦組織，利用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)GSK-3β在組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的差異，進(jìn)而明確其在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用。結(jié)果：GSK-3β在正常腦組織中呈高表達(dá)，為棕黃色細(xì)顆粒狀，主要表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中，其在膠質(zhì)瘤組織中呈低表達(dá)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，GSK-3β的表達(dá)水平隨著腫瘤級(jí)別的升高而逐步下降，WHO分級(jí)中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。但GSK-3β的表達(dá)水平與患者的性別和年齡無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論：GSK-3β的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而逐步下降，表明其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能具有抑癌作用，GSK-3β有望成為治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤； GSK-3β； 免疫組織化學(xué)； 腦

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First-author’s address：The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511447，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.22.007

膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，亦稱神經(jīng)膠質(zhì)瘤。其是起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤［1-3］。關(guān)于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制目前研究的還不甚透徹，并且此類腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)非常明顯，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞與正常腦組織的邊界難以區(qū)分，通過手術(shù)難以切除干凈，因此外科治療效果不甚理想［3-4］。另外，通常的放化療副作用大，且難以有效抑制腫瘤，從而復(fù)發(fā)率高。目前的臨床數(shù)據(jù)表明，患者的5年生存率僅5%左右［5-6］。因此，了解膠質(zhì)瘤的發(fā)病過程，對(duì)其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行探討，將可為臨床治療提供新的思路。GSK-3（Glycogen synthase kinase-3，糖原合酶激酶-3）是表達(dá)廣泛的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β兩個(gè)異構(gòu)體組成，且在進(jìn)化上高度保守。目前對(duì)GSK-3β研究的最為廣泛深入，而關(guān)于GSK-3α的功能還知之甚少［7］。GSK-3β在所有組織中都有表達(dá)，而在腦組織中的表達(dá)幅度尤為富集。GSK-3β首先被發(fā)現(xiàn)的功能是可以抑制糖原的合成，而隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)其作用相當(dāng)廣泛，可對(duì)多種底物包括轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡與遷移等，因而GSK-3β是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)激酶［8］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但有關(guān)GSK-3β和膠質(zhì)瘤的研究目前較少［9］。因此，本研究對(duì)正常腦組織和不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中GSK-3β的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從而探討其在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的意義。

1　材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本共41份，均來源于2010年4月-2013年3月本院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)切除的患者。術(shù)前均未行放、化療，且為第1次手術(shù)切除，并經(jīng)病理證實(shí)，按WHO分級(jí)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)。同時(shí)選擇高血壓腦出血或顱腦損傷患者行內(nèi)減壓手術(shù)時(shí)的腦組織標(biāo)本9例作為對(duì)照組，石蠟標(biāo)本由本院病理科負(fù)責(zé)切片提供，以4μm厚連續(xù)切片4張。

1.2HE染色 二甲苯脫蠟2次，10 min/次；濃度梯度酒精（100%-90%-80%-70%）作用2 min/次，蒸餾水洗2遍，1 min/次。加入蘇木素染液染色10 min，水洗1 min。加入分化液（1%鹽酸酒精）分化3 s，水洗。加入伊紅液浸染2 min，水洗后濃度梯度酒精（80%-90%-100%）分別脫水2、4、5 min。移入二甲苯Ⅰ中透明3～5 min，移入二甲苯Ⅱ中透明5～10 min，樹膠封固。

1.3免疫組化SP法 68 ℃烤片后，進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。加入3% H2O2于37 ℃孵育10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用PBS沖洗5 min，重復(fù)3次。加入0.01M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，重復(fù)上述步驟PBS沖洗。加入正常羊血清工作液封閉，然后滴加GSK-3β一抗（CST公司）于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB/H2O2反應(yīng)進(jìn)行染色，自來水沖洗充分后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性的乳腺癌組織作為陽性對(duì)照。

1.4GSK-3β表達(dá)分析 200倍顯微鏡下觀察，按隨機(jī)原則選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，呈棕黃色染色的細(xì)胞為GSK-3β表達(dá)陽性細(xì)胞，總的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)記為n1，再計(jì)算總的膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)記為n2，n1/n2即為標(biāo)記指數(shù)（Label index，LI），取其平均值。對(duì)每例標(biāo)本的GSK-3β表達(dá)標(biāo)記指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，分析其表達(dá)與臨床病理的關(guān)系［10］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間標(biāo)記指數(shù)的比較采用兩組獨(dú)立樣本間的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤HE染色觀察 HE染色圖中可見腫瘤細(xì)胞大小不一，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，且核異型性明顯，核槳比例增大；隨著WHO級(jí)別的升高，瘤細(xì)胞的密度逐漸增大，有的可見瘤巨細(xì)胞，見圖1。

2.2GSK-3β在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的表達(dá)差異 SP法免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GSK-3β主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色致密細(xì)顆粒狀（圖2）。GSK-3β在正常腦組織中呈高表達(dá)，平均標(biāo)記指數(shù)為58.43%，在膠質(zhì)瘤組織中相對(duì)低表達(dá)，平均標(biāo)記指數(shù)為20.84%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.928，P＜0.01）。而在膠質(zhì)瘤組織中，GSK-3β在Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中仍然表達(dá)較高，Ⅱ級(jí)中中等表達(dá)，Ⅲ級(jí)中低表達(dá)，Ⅳ級(jí)中極低或無表達(dá)（圖2）。

圖1 膠質(zhì)瘤HE染色結(jié)果（×200）

圖2 免疫組化SP法檢測(cè)GSK-3β的表達(dá)（×200）

2.3GSK-3β表達(dá)的臨床意義 共檢測(cè)41例膠質(zhì)瘤標(biāo)本，其中男21例，女20例，平均標(biāo)記指數(shù)分別為22.0%和19.6%，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.503，P=0.618）。按年齡段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，年齡2～66歲，中位年齡32歲，分為≤20歲、20～40歲、40～60歲和≥60歲4個(gè)年齡段，病例數(shù)分別為13、12、15和1例，平均標(biāo)記指數(shù)分別為28.4%、18.0%、17.0%和15.5%，各年齡組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。按腫瘤類型劃分，其中星形細(xì)胞瘤11例，室管膜瘤9例，少支膠質(zhì)細(xì)胞瘤9例，混合性膠質(zhì)瘤7例，多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3例，髓母細(xì)胞瘤和胚胎發(fā)育不良性上皮瘤各1例，陽性細(xì)胞率分別為6.5%、15.0%、22.7%、39.9%、39.5%、0和42.9%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。按WHO分級(jí)劃分，Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ級(jí)14例，Ⅳ級(jí)8例，平均標(biāo)記指數(shù)分別為40.6%、26.8%、16.4%、0.8%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008、0.006、0.000）

3　討論

人們最初發(fā)現(xiàn)GSK-3β是一種磷酸化糖原合成酶，促使葡萄糖進(jìn)行糖酵解代謝［11］。不過隨著研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)GSK-3β作用相當(dāng)廣泛，它能磷酸化多種底物，例如轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶類等，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等。其在體內(nèi)與多種生理病理活動(dòng)相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、遷移、胚胎發(fā)育、血管生成和微管微絲的穩(wěn)定等［12］。目前有關(guān)其在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如老年癡呆癥、中風(fēng)和精神病，以及糖尿病和炎癥中的治療研究表明，其有可能是比較有效的靶點(diǎn)之一［13］。

鑒于GSK-3β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要意義，其被認(rèn)為是一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。不過目前關(guān)于其是具有抑癌作用還是促癌作用仍然沒有定論［14-16］，有關(guān)研究表明，GSK-3β具有腫瘤抑制作用。例如在皮膚癌和乳腺癌中，GSK-3β活化或表達(dá)上調(diào)能夠抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展，這是因?yàn)镚SK-3β能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路而導(dǎo)致癌基因β-catenin磷酸化降解，并且在HIV-tat、血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）和PKC抑制劑staurosporine引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用［17］。不過同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在結(jié)腸癌、胰腺癌等表達(dá)上調(diào)，并且具有促腫瘤生長(zhǎng)作用。其機(jī)制是，GSK-3β能磷酸化NF-κB信號(hào)通路的成員，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的基因表達(dá)，最終對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用［18］。目前相互矛盾的觀點(diǎn)表明，在不同的腫瘤微環(huán)境下，GSK-3β可能表現(xiàn)出不同的功能，在某些腫瘤中，GSK-3β具有抑腫瘤生長(zhǎng)的作用；而在另一些腫瘤中，其具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能。上述的研究結(jié)果提示，GSK-3β在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用可能復(fù)雜多變，因此對(duì)于GSK-3β在不同腫瘤環(huán)境中的具體作用機(jī)制和信號(hào)通路調(diào)控的系統(tǒng)研究，將有助于腫瘤發(fā)生機(jī)制的正確認(rèn)識(shí)，從而為惡性腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)［19-20］。對(duì)于GSK-3β在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異，本研究進(jìn)行了全面系統(tǒng)的檢測(cè)分析。結(jié)果表明，GSK-3β在正常腦組織中呈高表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤組織中呈低表達(dá)，且GSK-3β的表達(dá)水平隨著腫瘤級(jí)別的升高而逐步下降。由上述結(jié)果可推測(cè)，GSK-3β在膠質(zhì)瘤中可能具有抑制癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的作用。Zhao等［21］研究表明，GSK-3β能通過mTOR/p70S6K1信號(hào)通路而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，其非活化形式p-GSK-3β（Ser9）的表達(dá)在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)。Gürsel等［22］從患者來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分離出具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GSK-3β第9位Serine的磷酸化水平后，細(xì)胞增殖能力下調(diào)，而凋亡增加；不過當(dāng)GSK-3β表達(dá)增加時(shí)，細(xì)胞增殖和克隆形成能力下降，而細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。因此，本研究的發(fā)現(xiàn)與目前的研究進(jìn)展相一致。

綜上所述，GSK-3β在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，其活性增加有可能會(huì)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移，因此GSK-3β有可能成為膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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Expression and Clinical Significance of GSK-3β in Glioma

ZHANG Feng，YANG Hong，LI Qing-tang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（22）：028-031

Objective：To analysis the expression and significance of GSK-3β in normal brain and different grade glioma tissues.Method：41 gliomas and 9 normal brain tissues were collected， and immunohistochemistry SP method was used to detect GSK-3β expression. Then its expression in different grades of glioma was analyzed，and its role in the development of gliomas was investigated.Result：GSK-3β was highly expressed in normal brain tissue，which was mainly localized in the cytoplasm with brown granular，its expression was low in the glioma tissues， compared two groups，the difference was statistically significant（P＜0.01）. The expression level of GSK-3β gradually decreased while the WHO grade of glioma increasing，there were statistically significant differences in the comparison of WHO classification Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ（P＜0.01）.But its expression level was not related to the gender and age of the patients.Conclusion：With the increase of the malignant degree of gliomas，the expression of GSK-3β decreased gradually，which indicated that it may play a role in the occurrence and development of glioma， and GSK-3β is expected to be a new target for the treatment of glioma.36-42.

Glioma； GSK-3β； Immunohistochemistry； Brain

①?gòu)V州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 廣東 廣州 511447
②廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院
③廣東三九腦科醫(yī)院

楊宏

（2016-01-22） （本文編輯：周亞杰）

（2016-05-23） （本文編輯：周亞杰）