鄯科明，滕中秋

?

膜電噴霧質(zhì)譜法快速檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷耐藥性

鄯科明1，滕中秋2,3,4

目的針對(duì)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播已成為全球重要公共衛(wèi)生問(wèn)題的現(xiàn)狀，擬建立細(xì)菌氨基糖苷耐藥性的快速檢測(cè)方法。方法基于膜電噴霧質(zhì)譜法，以ArmA蛋白的特異性肽段TYDVVFLLK (TK-9)特征性母子離子對(duì)為檢測(cè)目標(biāo)，建立了細(xì)菌氨基糖苷耐藥性的快速檢測(cè)方法。結(jié)果采用合成的標(biāo)準(zhǔn)肽段用于建立和驗(yàn)證定性定量檢測(cè)方法學(xué)。由于膜電噴霧離子化技術(shù)可大幅度提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，使得檢測(cè)流程僅需進(jìn)行2 h增菌，與微波酶解法配合運(yùn)用可最大程度縮短樣本前處理流程。結(jié)論經(jīng)驗(yàn)證該方法可成功檢測(cè)模擬真實(shí)環(huán)境樣本中細(xì)菌氨基糖苷耐藥性，具有極高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。在今后的研究中有望將該方法用于對(duì)環(huán)境樣本中其它細(xì)菌耐藥蛋白的快速檢測(cè)。

膜電噴霧離子化；快速檢測(cè)；細(xì)菌耐藥；ArmA

Rapid detection of bacterial aminoglycoside resistance using membrane electrospray ionization mass spectrometry

Supported by the Natural Science Foundation of China (No.81471919) and the Research Foundation of China CDC (No.2014A101).

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。細(xì)菌依靠可移動(dòng)元件如插入序列、質(zhì)粒和“耐藥基因組島”等可快速獲得抗生素耐藥性[2]。目前，雖有超過(guò)15種針對(duì)細(xì)菌不同生理或代謝功能而設(shè)計(jì)的抗生素得到廣泛應(yīng)用，但是在細(xì)菌的各種耐藥機(jī)制面前他們無(wú)一幸免[3]。面對(duì)每種抗生素，細(xì)菌都隨之進(jìn)化出了應(yīng)對(duì)策略，而其中的耐藥機(jī)制則與一系列的耐藥基因有關(guān)。例如細(xì)菌獲得qnrA/B/S基因則對(duì)氟喹諾酮類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性[3-4]，獲得blaCTX-M和blaNDM-1基因則對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性[5-7]，具有mcr-1則耐多黏菌素抗生素[8]，具有armA則耐氨基糖苷類(lèi)抗生素等等[9-10]。為防止不當(dāng)和過(guò)度使用抗生素，對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行定性、定量檢測(cè)成為迫切需求[11]。

用于對(duì)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法已有一些相關(guān)報(bào)道。例如，常規(guī)微生物學(xué)研究中經(jīng)常采用瓊脂稀釋法對(duì)細(xì)菌藥物敏感性進(jìn)行測(cè)試[12-13]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)耐藥基因的檢測(cè)[11,14]；此外近年來(lái)也有報(bào)道采用質(zhì)譜(MS)法對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性的檢測(cè)[15-16]。質(zhì)譜具有很高的靈敏度和特異性，是十分強(qiáng)大的分析工具。特別是近年來(lái)敞開(kāi)式電離技術(shù)(ambient ionization)的不斷發(fā)展，使復(fù)雜的樣本前處理過(guò)程得以大大縮短，讓快速檢測(cè)痕量復(fù)雜樣本成為可能。已報(bào)道的敞開(kāi)式電離技術(shù)包括：解析電噴霧電離(DESI)[17]，實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜(DART)[18]，紙噴霧電離(PS)[19-20]和膜電噴霧電離(MESI)[21]等等。

本文基于膜電噴霧質(zhì)譜法，以ArmA蛋白的特異性肽段TYDVVFLLK (TK-9)的特征性母子離子對(duì)為檢測(cè)目標(biāo)，建立了細(xì)菌高水平氨基糖苷耐藥性的快速檢測(cè)方法。這一方法在未來(lái)有望被繼續(xù)拓展，用于細(xì)菌其它耐藥基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑菌株信息詳見(jiàn)表1。腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司(中國(guó)北京)；尿素、硫脲、CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、 NH4HCO3, KH2PO4和K2HPO4購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(美國(guó))；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)于Promega公司(美國(guó))；色譜級(jí)甲酸(FA)、甲醇 (MeOH)購(gòu)于Fisher Scientific (美國(guó))；蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(#500-0204)購(gòu)于Bio-Rad公司(中國(guó)上海)；純水購(gòu)于娃哈哈集團(tuán)(中國(guó)杭州)；濾紙購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司(中國(guó)北京)；透析膜(截留分子量3.5 kDa和8-14 kDa)購(gòu)于伯易生物科技有限公司(中國(guó)上海)；合成肽段TYDVVFLLK (TK-9，經(jīng)MALDI-TOF MS及HPLC驗(yàn)證，純度> 95%)購(gòu)于Pepmic公司(中國(guó)蘇州)。

表1本文涉及的菌株信息

Tab.1Bacteria information used in this study

序號(hào)Entry細(xì)菌(菌株號(hào))Bacteria(Straincode)armA基因armAgene來(lái)源Source1鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-ZJ06)A.baumannii(MDR-ZJ06)+醫(yī)院來(lái)源(中國(guó)北京)HospitalinBeijing,China2鮑曼不動(dòng)桿菌(Ab-1)A.baumannii(Ab-1)-醫(yī)院來(lái)源(中國(guó)北京)HospitalinBeijing,China3大腸桿菌(A839)E.coli(A839)+醫(yī)院來(lái)源(中國(guó)北京)HospitalinBeijing,China4大腸桿菌(BL21)E.coli(BL21)-寶生物科技有限公司(中國(guó)大連)TakaraBiotechCo.Ltd.inDalian,China

1.2細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌菌株在腦心浸液(BHI)肉湯中37 ℃持續(xù)振蕩培養(yǎng)。新鮮BHI肉湯接種了1∶1 000稀釋的指數(shù)期培養(yǎng)(OD600=0.6)的菌株。初始培養(yǎng)濃度大約為1×106CFU/mL，記錄下OD600，并且提取不同培養(yǎng)時(shí)間的蛋白。

1.3PCR檢測(cè)菌株armA基因分離株通過(guò)PCR方法來(lái)確認(rèn)攜帶armA基因，包含引物ArmA-F: 5′-ATGGATAAGAATGATGTTGTT-3′和ArmA-R: 5′-TTTCTGAAATCCACGAGTAATA-3′。擴(kuò)增程序包含以下過(guò)程的30個(gè)循環(huán)，每個(gè)過(guò)程為：95 ℃ (30 s)，55 ℃ (30 s)，72 ℃ (45 s)，72 ℃ (8 min的延伸期)。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物(774 bp)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并通過(guò)ABI PRISM 3730XL測(cè)序儀(中國(guó)北京)測(cè)序驗(yàn)證。

1.4樣本制備細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白由裂解液超聲波提取(裂解液含：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲， 4 % CHAPS和1 % DTT)。裂解后的懸濁液于16 000 g離心15 min后取上清，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。使用微波法進(jìn)行蛋白酶切，即：蛋白樣品在50 μL的50 mmol/L碳酸氫銨溶液中溶解并且加入5 mmol/L DTT在95 ℃反應(yīng)5 min，隨后在15 mmol/L的IAA存在下在黑暗處反應(yīng)30 min。最后使用測(cè)序級(jí)胰酶按照酶/底物1∶50 (w/w)的比例加入胰蛋白酶，在700 W的微波下酶切15 min。

1.5膜電噴霧電離質(zhì)譜法(MESI-MS)分析MESI-MS分析使用Bruker HCT質(zhì)譜儀(德國(guó))。干燥氣為氮?dú)?流速10 L/min; 溫度150 ℃)；采用正離子模式；毛細(xì)管電壓為-1.5 kV。膜電噴霧電離裝置(MESI)如圖1所示：將雙層透析膜(約7 mm等邊三角形)壓實(shí)于已潤(rùn)濕的濾紙上，兩層透析膜具有不同的截留分子量，其中第一層透析膜的截留分子量為8～14 kDa, 第二層為3.5 kDa。透析膜和濾紙一并用銅夾固定于距質(zhì)譜進(jìn)樣口約5 mm的位置。樣本檢測(cè)過(guò)程全部為上樣2 μL樣本溶液至透析膜中間，等待30 s后移除第一層透析膜，在第二層透析膜后端施加3 kV電壓，同時(shí)在膜上加入8 μL沖洗溶劑(MeOH∶H2O∶FA=60∶40∶0.1, v/v)，在電壓推動(dòng)下樣本逐漸向前移動(dòng)，在三角形透析膜尖端形成噴霧，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

圖1　膜電噴霧離子源裝置的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Instrumental setup of MESI-MS ion source

2　結(jié)　果

2.1ArmA蛋白特異性肽段的選擇特異性肽段從細(xì)菌耐藥蛋白ArmA的理論酶切肽段通過(guò)在Exapasy (http://web.expasy.org/peptide_mass/)檢索獲得。采用BLAST算法驗(yàn)證理論酶切肽段在細(xì)菌中沒(méi)有同源性。特異性肽段的選擇需遵循以下幾個(gè)原則：1)是ArmA蛋白特有的；2)有很高的質(zhì)譜強(qiáng)度和離子化效率；3)無(wú)不穩(wěn)定的氨基酸和胰蛋白酶漏切位點(diǎn)。最終本文篩選確定肽段TYDVVFLLK (TK-9)進(jìn)行合成，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2膜電噴霧電離電壓的優(yōu)化在實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)膜電噴霧直流電壓的選擇進(jìn)行優(yōu)化。分別嘗試了不同電壓范圍(1～3 kV)條件下對(duì)MESI-MS響應(yīng)的影響。當(dāng)電壓低于1 kV時(shí)，難以形成噴霧；而當(dāng)電壓高于3 kV時(shí)容易在空氣中產(chǎn)生放電，無(wú)法形成穩(wěn)定而有效的噴霧。最終經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，我們選擇了3 kV電壓作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。

2.3MESI-MS檢測(cè)ArmA特異性肽段采用PCR方法確認(rèn)菌株是否攜帶armA基因(圖2)。圖3記錄了菌株的生長(zhǎng)曲線上各時(shí)間點(diǎn)的菌體總蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)肽段的最低檢出限(LOD)和提取蛋白的濃度，可推測(cè)增菌所需的最短時(shí)間。在本發(fā)明涉及的示例菌株中，2 h增菌即可產(chǎn)生足夠量的ArmA用于MEIS-MS/MS檢測(cè)。不同的菌株產(chǎn)生蛋白的能力不同，所以對(duì)不同的菌，最少培養(yǎng)時(shí)間也可能不同。不排除后續(xù)檢測(cè)菌株增菌時(shí)長(zhǎng)低于2 h的情況。圖4A為合成標(biāo)準(zhǔn)ArmA特異性肽段(1 mmol/L)的MESI-MS/MS分析。肽段TK-9的特征性母子離子對(duì)為m/z549.2→833.2。

圖2　PCR方法驗(yàn)證菌株攜帶/不攜帶armA基因Fig.2　Bacteria strains with/without armA gene verified by PCR assay

圖3　細(xì)菌分離株增菌不同時(shí)間時(shí)的蛋白濃度Fig.3　Protein concentration determination of bacteria strains after different cultural time

MESI-MS使得質(zhì)譜快速分析具有顯著去除基質(zhì)效應(yīng)的能力，固而在本方法中脫鹽步驟可省略，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間。將特異性肽段作為檢測(cè)目標(biāo)，間接檢測(cè)ArmA而非直接檢測(cè)ArmA本身，使得可以巧妙的運(yùn)用MESI-MS的透析膜去除樣本中干擾分析的因素。其中，樣品體系內(nèi)殘余的胰蛋白酶可通過(guò)第一層透析膜除去(MWCO 8-14 kDa)。在胰蛋白酶消化過(guò)程中引入的鹽和其他小分子可通過(guò)第二層透析膜(MWCO 3.5 kDa)除去。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證本文從不攜帶armA基因的菌株(Ab-1 and BL21)中提取所得蛋白的酶切肽段作為空白基質(zhì)，用以考察添加該空白基質(zhì)合成肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性度，最低檢出限(LOD, S/N=5)和最低定量限(LOQ, S/N=15)。通過(guò)MESI-MS檢測(cè)一些列濃度梯度肽段TK-9的特征性母子離子對(duì)，可知其：線性回歸方程為y=0.287 9 x+4.076 8；相關(guān)系數(shù)(r2)為0.993 8；線性范圍為1～1000 fmol·μL-1；LOD為1 fmol·μL-1；LOQ為2 fmol·μL-1。采用質(zhì)控樣本(濃度分別為10和50 fmol·μL-1的合成肽段)考察方法精密度、準(zhǔn)確度和回收率(如表2所示)。通過(guò)檢測(cè)高低不同濃度的特異性肽段，驗(yàn)證了方法學(xué)具有較好的精密度、準(zhǔn)確度及回收率。

表2MESI-MS分析的方法學(xué)驗(yàn)證 (n=5)

Tab.2Methodology validation of MESI-MS analysis (n=5)

質(zhì)控樣本QCsample質(zhì)控樣本濃度ConcentrationofQCsample(fmol·μL-1)精密度Precision(RSD%)準(zhǔn)確度Accuracy(RE%)回收率Recovery(%,x±s)肽段TK-9100.571.2995.08±1.12PeptideTK-9500.351.1793.73±0.88

3　模擬環(huán)境樣品的快速測(cè)定

真實(shí)衛(wèi)生環(huán)境檢測(cè)采用在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)拭子法從表面獲得的環(huán)境樣本[22]，向其中添加有鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-ZJ06 and Ab-1)以及大腸桿菌(A839 and BL21)。經(jīng)過(guò)2 h的增菌培養(yǎng)胰酶消化后，采用上述建立的MESI-MS/MS方法，成功識(shí)別到模擬環(huán)境樣品中的肽段TK-9 (如圖4B所示)，而陰性對(duì)照樣本檢測(cè)不到TK-9的存在。由此可見(jiàn)，本文所建立的新方法整體檢測(cè)流程在3 h內(nèi)可完成，對(duì)添加了攜帶或不攜帶armA基因的不同種細(xì)菌(鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌)的模擬環(huán)境樣本進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了具有高靈敏度與準(zhǔn)確度的快速檢測(cè)。

A. 合成標(biāo)準(zhǔn)肽段； B. 模擬真實(shí)樣本

4　結(jié)　論

綜上述所，本文采用膜電噴霧質(zhì)譜法對(duì)ArmA特異性肽段TK-9的特征性母子離子對(duì)的檢測(cè)，建立了對(duì)細(xì)菌攜帶氨基糖苷耐藥基因表達(dá)蛋白ArmA的快速檢測(cè)方法。這一新方法具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，所需的增菌、胰酶消化及質(zhì)譜檢測(cè)整體流程可在3 h內(nèi)完成對(duì)細(xì)菌氨基糖苷耐藥性的檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證該方法具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。

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SHAN Ke-ming1, TENG Zhong-qiu2,3,4

(1.PlanningandResearchInstitute,NorincoGroup,Beijing100053,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,Beijing102206,China;4.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,

Hangzhou310003,China)

Antibiotic resistance in pathogenic bacteria is becoming a global public health problem, such as aminoglycoside resistance encoded byarmAgene. Rapid analysis of environmental samples is still challenging although many methods reported,A rapid analytical method was developed to identify bacterial high-level aminoglycoside resistance by using membrane electrospray ionization mass spectrometry (MESI-MS) in this study. The precursor/production pair of peptide TYDVVFLLK (TK-9) unique to ArmA was detected as the target analyte. Synthesized standard peptide was used for developing and validating the methodology. MESI-MS with two layers of membrane offers high sensitivity so that only 2 hours was needed for bacterial culture. The novel assay offered a rapid method to determine bacterial aminoglycoside resistance with high sensitivity, accuracy and precision in simulated environmental samples within 3 hours. This method could also be applied to identify other drug-resistance protein in clinical/environmental samples.

membrane electrospray ionization; rapid analysis; drug-resistance; ArmA

Teng Zhong-qiu, Email: tengzhongqiu@icdc.cn

滕中秋，Email: tengzhongqiu@icdc.cn

1.中國(guó)兵器工業(yè)規(guī)劃研究院，北京100053；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206；3.傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；4.感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310003

R378

A

1002-2694(2016)06-0564-05

2016-02-14；

2016-04-22

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.011

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 81471919)和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心青年科研基金 (No. 2014A101)聯(lián)合資助