周偉強（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧　沈陽110034）

瘦素誘導乳腺癌三陰細胞系MDA-MB-231侵襲的形態(tài)學觀察

周偉強
（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧沈陽110034）

目的：研究瘦素對乳腺癌三陰細胞系MDA-MB-231侵襲力的影響。方法：采用細胞劃痕、Transwell細胞侵襲力測定等方法從形態(tài)學角度觀察瘦素對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲力產(chǎn)生的影響。結果：與對照組相比，瘦素可顯著增強乳腺癌MDA-MB-231細胞向劃痕中心移走的能力。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)瘦素處理后的乳腺癌細胞侵襲性較對照組細胞明顯增強，穿透Transwell基底膜的細胞數(shù)量增多，細胞鋪展良好，顯示出較好的生長狀態(tài)。結論：瘦素可誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞的游走，增強其侵襲力。

瘦素；乳腺癌；MDA-MB-231；侵襲力

doi：10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.04.003

［Abstract］Objective：To study the influence of Leptin on cell invasiveness in triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Method：Cell scratching and Transwell invasion assay were used to observe the impact of Leptin on cell invasiveness. Results：Compared with the control group，Leptin could significantly enhance the MDA-MB-231 migration to the center of scratches.Transwell experiment found that，compared to control cells，the invasive ability of MDA-MB-231 cells significantly increased with Leptin induction.It was displayed for the increasing cells that had penetrated the basement membrane and spread well. Conclusion：Leptin can significantly induce the migration and invasiveness for the breast cancer MDA-MB-231 cells.

［Key words］Leptin；breast cancer；MDA-MB-231；invasiveness

三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）作為一種特殊的乳腺癌類型，其免疫組化標記雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達均陰性，約占全部乳腺癌類型的15％左右［1-3］。由于TNBC具有惡病質(zhì)高、易侵襲和轉(zhuǎn)移，且治愈后易復發(fā)的特點［4］，因此研究其致病機制并尋找有效的的預防和治療手段是乳腺癌治療和預防領域所面臨的重大問題之一。

瘦素（Leptin）作為一種脂肪細胞因子，通過與其特異受體OB-Rb結合刺激乳腺癌細胞增殖［5］。但Leptin是否能通過機體內(nèi)環(huán)境以自分泌或旁分泌途徑刺激乳腺鄰近上皮細胞使其增殖，目前還沒有定論。因此本研究將Leptin作用于乳腺癌三陰細胞系MDA-MB-231，通過形態(tài)學實驗觀察Leptin對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本實驗室凍存；Leibovitz's L-15培養(yǎng)基、胎牛血清等細胞培養(yǎng)試劑購自美國Thermo公司；人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞染色液購自美國Cell Biolabs公司；其他的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含15％胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2細胞劃痕實驗將3×105/ml的MDA-MB-231細胞接種于24孔板的各孔中。當細胞鋪滿至90％時，用無菌200 μl移液槍頭在24孔板各孔中心位置劃一條垂直線。PBS液洗3次去除劃下的細胞后加入無血清Leibovitz's L-15培養(yǎng)基同步化處理24 h。加入0.625 nmol/L的Leptin與MDAMB-231細胞共同孵育0、4、12、24、32、48、72 h后分別取樣加入400 μl細胞染液。待染色15 min后在Leica DMI6000 B相差顯微鏡下觀察。

1.2.3Transwell實驗取用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基稀釋的100 μl Matrigel膠分別加入24孔Transwell各室中，37℃孵育4 h。將6×106/ml乳腺癌細胞系MDA-MB-231培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞鋪滿率＞50％時，加入0.625 nmol/L Leptin共同孵育32 h后，以5×105/ml比例懸浮細胞并移入Transwell上室200 μl，Transwell下室加入含5 μg/ml纖維連接蛋白（fibronectin）的600 μl細胞培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h。將附有細胞的Transwell膜剪下后經(jīng)1 mmol/L Calcein AM（1∶500稀釋）染色10 min后在Leica DMI6000 B熒光顯微鏡下觀察。

圖1　Leptin可顯著增強乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移力

2　結果

2.1Leptin可顯著增強乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移力Leptin處理MDA-MB-231細胞12 h就有明顯的誘導乳腺癌細胞向劃痕中心移走的作用；48 h后移走的細胞基本填滿劃痕缺口；72 h后完全封閉。而對照組細胞向劃痕中心移動的程度明顯小于Leptin處理組的細胞，細胞72 h才基本填滿劃痕缺口。見圖1。

2.2Leptin顯著增強乳腺癌細胞系細胞侵襲力

Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，Leptin處理后的乳腺癌細胞侵襲性較對照組細胞明顯增強，穿透Transell基底膜的細胞數(shù)量增多，細胞鋪展良好，顯示較好的生長狀態(tài)，而非Letptin處理的對照組細胞侵襲性明顯減弱，穿透膜的細胞數(shù)明顯減少。見圖2。

圖2　Leptin顯著增強乳腺癌細胞系細胞侵襲力（×10；左側是相差顯微鏡照片；右側是熒光顯微鏡照片）

3　討論

乳腺癌的高侵襲、高轉(zhuǎn)移性是目前乳腺癌治療的關鍵［6］。而Leptin通過與其特異受體Ob-Rb結合誘發(fā)乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，目前國內(nèi)外已有相關報道［7-11］，但具體作用機制不清。我們先前實驗也證明，Leptin可誘導乳腺癌細胞膜表面白細胞介素1受體-I的高表達，進而引發(fā)胞質(zhì)白細胞介素1家族蛋白分泌的增加，通過激活胞內(nèi)JAK/STAT、MAPK、cAMP/PI3K等蛋白激酶途徑，上調(diào)NF-κ B、VEGF等胞內(nèi)效應分子表達水平，促進新生血管形成，加速乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展［12］。在乳腺癌細胞系4T1、EMT6和MMT細胞中都可檢測到Leptin和VEGF的表達；通過免疫組化實驗可以觀察到OB-R、VEGFR2在乳腺癌細胞中高表達；另外固相血管增生抗體芯片篩查實驗也證實了經(jīng)Leptin作用后乳腺癌MDA-MB-231細胞中與血管增生相關的蛋白表達作用明顯，其中Ang-1、Ang-2、FLG、CXCL16、VEGF、IL-1Β、MMP-8等表達明顯增高，這說明Leptin可作為一種新型促血管生成因子參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

本文從形態(tài)學角度觀察了Leptin誘導乳腺癌的侵襲，從一種全新的角度研究了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機制，是對Leptin在乳腺癌發(fā)生過程中的作用機制的有力補充，具有重要的科學和臨床應用價值。當然Leptin任何誘導乳腺癌侵襲，其作用途徑有哪些，均有待進一步研究。

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（文敏編輯）

Morphological Study for the Cell Invasiveness in Triple-negative Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231 Induced by Leptin

ZHOU Weiqiang
（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

R394.3

A

1008-2344（2016）04-0234-03

國家自然科學基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授，研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com

2016-05-11