劉肖萍，林毅（華僑大學化工學院，福建廈門361021）

Cry1A型殺蟲晶體蛋白活性區(qū)的空間結構比較分析

劉肖萍，林毅
（華僑大學化工學院，福建廈門361021）

對9種代表性Cry1A型殺蟲晶體蛋白成員進行活性區(qū)空間結構的同源模建與比較分析.分析結果表明：DomainⅠ和DomainⅢ相對保守，其中，DomainⅠ整體走向及結構基本重疊，只有Cry1Aa和Cry1Af多了一個螺旋；DomainⅡ的主要差異體現(xiàn)在loop上；將DomainⅢ結構一致的成員Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae和Cry1Af歸為一個亞型，其他5種成員歸為另一個亞型.研究確定了影響Cry1A型殺蟲晶體蛋白結構差異的關鍵氨基酸及關鍵結構片段.

蘇云金桿菌；Cry1A型殺蟲晶體蛋白；空間結構差異；構效關系

蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種產(chǎn)孢型昆蟲病原菌.從Bt中已分離和鑒定出的昆蟲毒性蛋白有10多種［1］，其中，最重要的是Cry系列毒素蛋白［2］.Cry1A類蛋白原毒素被酶水解后，形成活性毒素蛋白片段，活性區(qū)由3個結構域構成，DomainⅠ位于N端，由反向平行的α螺旋構成；DomainⅡ由3個β－折疊片層構成β－棱柱結構［3］；DomainⅢ則由2個彎曲的反向平行β－折疊構成.Cry1A類蛋白中，已經(jīng)測得的晶體結構有Cry1Aa（PDB ID：1CIY）［4］與Cry1Ac（PDB ID：4ARY）［5］.Cry1A類蛋白的殺蟲機制是與中腸上皮細胞的毒素受體結合、構象變化引起寡聚化以及插入細胞膜形成孔洞，最后導致昆蟲死亡［6－7］.Cry1A類蛋白經(jīng)胰蛋白酶活化后，與不同的受體結合，受體主要有氨肽酶N（APN）、堿性磷酸酶（ALP）和鈣黏蛋白類［6，8－11］.Cry毒素已經(jīng)被廣泛應用于對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲及植物病原線蟲的防治［8］.轉Cry基因農作物已被大面積種植，有效地控制了鱗翅目與鞘翅目害蟲的危害［12］.然而，目前已經(jīng)超過60%的害蟲對轉基因作物產(chǎn)生了抗性，而Cry1A類的蛋白占抗性總數(shù)的41%［13］.Cry1A蛋白有10種成員，共有107個蛋白.其中，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac分別有24，34和38個蛋白，同源性高于95%的蛋白比例較高，結構較為相似.本文構建了Cry1A蛋白中9種成員的活性區(qū)空間結構，比較分析其結構差異，并結合現(xiàn)有的活性信息探討其構效關系.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和服務器

基因與蛋白質序列檢索比對數(shù)據(jù)庫NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／GenBank），獲取9個代表蛋白質氨基酸序列；蛋白質結構數(shù)據(jù)庫Protein Data Bank（http：∥www.rcsb.org／pdb／home／home.do）；序列比對服務器（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／muscle／）；Swiss－Model服務器（http：∥swissmodel.expasy.org／interactive）預測三級結構模型；蛋白質三級結構分析軟件PyMOL.

1.2 分析方法

1.2.1 Cry1A類蛋白質結構預測結果 分別取Cry1Aa1，Cry1Ab1，Cry1Ac1，Cry1Ad1，Cry1Ae1，Cry1Af1，Cry1Ag1，Cry1Ah1和Cry1Ai1為Cry1A類蛋白質代表，通過Swiss－Model服務器進行同源建模，得到其活性區(qū)的空間結構.其中，Cry1Aa和Cry1Ac已測得晶體結構，其PDB ID分別為ICIY和4ARY.因為Cry1Ac晶體結構帶有配體，所以它不適合作為建模的模板，對它進行同源建模，Cry1A類蛋白的結構皆以Cry1Aa為模板進行預測.

1.2.2 構效關系分析 在蛋白質三級結構分析軟件PyMOL中，打開9個Cry1A類殺蟲晶體蛋白成員三級結構，讀取二級結構，并進行三級結構之間的比對.

2 結果與分析

2.1 二級結構的特征分析

Cry1A類蛋白共有9種成員，對各個代表蛋白質進行二級結構元件描述.結果顯示，DomainⅠ非常保守，與其他種蛋白相比，Cry1Aa在螺旋α7上被loop分為2個螺旋，Cry1Af在α5上被loop分為2個螺旋；DomainⅡ則差異較大，主要差異體現(xiàn)在結構元件α9，β4，β6b，β8，β11b和α11上，Cry1Ab，Cry1Ae和Cry1Af在二級結構元件上完全一致，Cry1Ah和Cry1Ai在二級結構元件上也完全一致，其他成員在二級結構元件上都有差異；DomainⅢ相對較保守，其中，Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae，Cry1Af和Cry1Ag在結構元件上完全一致，Cry1Ah和Cry1Ai在結構元件上也完全一致.

2.2 Cry1A不同成員間活性區(qū)空間結構差異分析

2.2.1 DomainⅠ結構差異 Cry1A不同成員間的DomainⅠ氨基酸序列比較結果，如圖1所示.由圖1可知：Cry1Aa和Cry1Af有9個螺旋，而其他成員只有8個螺旋，原因是Cry1Aa和Cry1Af第184～200位的氨基酸與其他成員相比差異很大，導致Cry1Aa和Cry1Af在175～179位比其他成員多了1個螺旋.Cry1Ab和Cry1Ad的DomainⅠ完全重疊，而其他成員的DomainⅠ結構走向與相似度非常高.

Cry1Ab與Cry1Af的DomainⅠ結構比對，如圖2所示.其他成員因與這兩個成員非常類似，因此，未在圖2中表示.

2.2.2 DomainⅡ結構差異 Cry1A不同成員間的DomainⅡ結構差異主要體現(xiàn)在loop上，其比對結果如圖3所示.由圖3可知：Cry1Ab與Cry1Af完全重合；差異較小的分別是Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ae 與Cry1Af，Cry1Ac與Cry1Ah，其他兩兩成員之間的結構差異較大，幾乎無法重合.

Cry1A不同成員間DomainⅡ的氨基酸序列比對，如圖4所示.由圖4可知：Cry1Aa，Cry1Ac，Cry1Ag，Cry1Ah和Cry1Ai與其他成員相比，有1個很顯著的差異.前者的348～351氨基酸表現(xiàn)為β片層，后者則為無規(guī)則卷曲，原因是343位氨基酸存在差異.雖然β片層的核心區(qū)相似度非常高，但是連接相鄰β片層的loop卻表現(xiàn)出巨大的差異.氨基酸在368～380位、391～397位、435位、440位、442位和447位的不同是造成這些差異的主要原因.

圖1 Cry1A型不同成員DomainⅠ氨基酸序列比對結果Fig.1 Sequence alignment of DomainⅠof Cry1Aproteins

圖2 Cry1Ab與Cry1Af的DomainⅠ結構對比Fig.2 Structural comparison of DomainⅠbetween Cry1Ab and Cry1Af

圖3 Cry1A不同成員間DomainⅡ結構比對Fig.3 Structural comparison of DomainⅡamong Cry1Aproteins

Cry1Aa，Cry1Ab與Cry1Ae的差異主要體現(xiàn)在loopsβ5－β6，β6－β7和β10－β11，表現(xiàn)為卷曲方式和長度差異；Cry1Ab與Cry1Ae在loopsβ5－β6，β6－β7存在差異.2.2.3 DomainⅢ結構非常保守 Cry1A不同成員間DomainⅢ空間結構比對結果，如圖5所示.由圖5可知：Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae和Cry1Af完全重合，其對應的氨基酸序列差異非常小，其中，Cry1Aa和Cry1Ab完全一致.Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae和Cry1Af與其他5個Cry1A成員存在較大差異.因此，Cry1A型殺蟲晶體蛋白可據(jù)此劃分成2個亞型：Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae和Cry1Af為一個亞型，以Cry1Ab為代表；其他4個成員歸為另一個亞型.2個亞型比較結果表明，DomainⅢ的結構相對DomainⅠ和DomainⅡ較為保守.特別地，雖然Cry1Ah和Cry1Ai 的DomainⅢ氨基酸序列同源性非常高，但其三級結構差異卻很大.

圖4 Cry1A不同成員間DomainⅡ的氨基酸序列比對結果Fig.4 Sequence alignment of DomainⅡof Cry1Aproteins

圖5 Cry1A不同成員DomainⅢ氨基酸序列比對結果Fig.5 Sequence alignment of DomainⅢof Cry1Aproteins

3 討論

Cry蛋白的DomainⅠ參與了殺蟲晶體蛋白在昆蟲中腸細胞的膜表面形成孔道；親水氨基酸殘基暴露在蛋白表面，疏水殘基尤其是芳香族氨基酸則被包裹在蛋白內側，指向位于中心的α－5螺旋［14］.與天然Cry1A類蛋白相比，去除掉α－1和部分α－2的改造Cry1A類蛋白具有更高毒力且擴大了殺蟲譜.這是由于改造后的蛋白不用與鈣黏蛋白進行結合，而是直接簡易地形成聚合物［15－16］.對DomainⅠ螺旋上的一些氨基酸位點進行突變，發(fā)現(xiàn)成孔能力有所改變，導致殺蟲活性有一定的變化［17－20］.文中研究結果表明：Cry1A不同成員之間的DomainⅠ相當保守，Cry1A類蛋白的成孔能力及與鈣黏蛋白結合的能力相差不大.Cry1Af的DomainⅠ在螺旋α－5處與其他成員存在明顯差異，可能會導致Cry1Af有特殊的活性，但目前沒有相關的活性信息.

許多研究表明，DomainⅡ結構的loop上，氨基酸的突變會改變殺蟲晶體蛋白的活性.Cry1Aa的loopβ10～loopβ11中，Y445C的突變降低了其與BtR175受體的結合，從而導致了Cry1Aa對家蠶的毒性顯著降低［21］.Cry1Ab的loop 2上N372A的突變，使Cry1Ab對舞毒蛾的毒性大大增加［22］.將Cry4Aa的loop 3取代Cry1Aa的loop 3后發(fā)現(xiàn)，Cry1Aa對蚊蟲有毒性，這說明loop對活性產(chǎn)生較大的影響［23］.將Cry1Ah和Cry1Ai的loop 2進行交換，發(fā)現(xiàn)Cry1Ai獲得了對棉鈴蟲的殺蟲活性，而Cry1Ah則失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性，但loop 2的互換并沒有改變兩種蛋白對家蠶的原有活性，這說明DomainⅡ的loop 2與棉鈴蟲殺蟲特異性密切相關.而兩個蛋白的loop 3互換時，不但沒有使Cry1Ai獲得對棉鈴蟲的殺蟲活性，反而導致Cry1Ah失去了對棉鈴蟲的殺蟲活性，這說明loop 3對Cry1Ah和Cry1Ai保持原有的棉鈴蟲的殺蟲活性比較重要［24］.Cry1A不同成員之間的loop差異較為明顯，且現(xiàn)有活性信息也顯示loop對Cry1A活性有影響，Cry1Aa與Cry1Ae因loop上的差異表現(xiàn)出截然不同的活性，而Cry1Aa與Cry1Ab的loop差異未在現(xiàn)有活性信息中體現(xiàn).

Cry蛋白的DomainⅢ可能有2個功能：保持結構的完整性；引導毒素蛋白的DomainⅡ的特異性受體結合［25］.將Cry1Ab的DomainⅢ替換為Cry1Ca的DomainⅢ后，對甜菜夜蛾的活性有所提升［26］.Cry1Aa與Cry1Ac或Cry1Aa與Cry1Ab DomainⅢ互換實驗，表明DomainⅢ影響毒性和受體結合能力［27－28］.文中研究結果顯示，Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae和Cry1Af的DomainⅢ完全重合，而與其他4個Cry1A殺蟲晶體蛋白成員差異較大.Cry1Aa，Cry1Ab和Cry1Ad都對甜菜夜蛾有活性，結合DomainⅡ的構效分析，推測Cry1Af對甜菜夜蛾也可能有活性.

［1］ DE MAAGD R A，BRAVO A，BERRY C，et al.Structure，diversity，and evolution of protein toxins from sporeforming entomopathogenic bacteria［J］.Annual Review of Genetics，2003，37（1）：409－433.

［2］ SCHNEPF E，CRICKMORE N，VAN RIE J，et al.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（3）：775－806.

［3］ SHIMIZU T，MORIKAWA K.The beta－prism：A new folding motif［J］.Trends in Biochemical Sciences，1996，21 （1）：3－6.

［4］ GRPCHULSKI P，MASSON L，BORISOVA S，et al.Bacillus thuringiensis CryIA（a）insecticidal toxin：Crystal structure and channel formation［J］.Journal of Molecular Biology，1995，254（3）：447－464.

［5］ DERBYSHIRE D J，ELLAR D J，LI J.Crystallization of the Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac and its complex with the receptor ligand N－acetyl－D－galactosamine［J］.Acta crystallographica，2001，57（12）：1938－1944.

［6］ PARDO－LPEZ L，SOBERN M，BRAVO A.Bacillus thuringiensis insecticidal three－domain Cry toxins：Mode of action，insect resistance and consequences for crop protection［J］.Fems Microbiology Reviews，2013，37（1）：3－22.

［7］ VACHON V，LAPRADE R，SCHWARTZ J L.Current models of the mode of action of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins：A critical review［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2012，111（1）：1－12.

［8］ ARENAS I，BRAVO A，SOBERN M，et al.Role of alkaline phosphatase from Manduca sextain the mechanism of action of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin［J］.Journal of Biological Chemistry，2010，285（17）：12497－12503.

［9］ KNIGHT P J，CRICKMORE N，ELLAR D J.The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA（c）delta－endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase N［J］.Molecular Microbiology，1994，11（3）：429－436.

［10］ PIGOTT C R，ELLAR D J.Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2007，71（2）：255－281.

［11］ VADLAMUDI R K，WEBER E，JI I，et al.Cloning and expression of a receptor for an insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis［J］.Journal of Biological Chemistry，1995，270（10）：5490－5494.

［12］ RIE J V.Bacillus thuringiensis and its use in transgenic insect control technologies［J］.International Journal ofMedical Microbiology，2000，290（4／5）：463－469.

［13］ LUCENA W A，PELEGRINI P B，MARTINS－DE－SA D，et al.Molecular approaches to improve the insecticidal activity of Bacillus thuringiensis Cry toxins［J］.Toxins（Basel），2014，6（8）：2393－2423.

［14］ LI J D，CARROLL J，ELLAR D J.Crystal structure of insecticidal delta－endotoxin fromBacillus thuringiensis at 2.5Aresolution［J］.Nature，1991，353（6347）：815－821.

［15］ MUZ－GARAY C，PORTUGAL L，PARDO－LPEZ L，et al.Characterization of the mechanism of action of the genetically modified Cry1AbMod toxin that is active against Cry1Ab－resistant insects［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2009，1788（10）：2229－2237.

［16］ SOBERN M，PARDO－LPEZ L，LPEZ I，et al.Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance［J］.Science，2007，318（5856）：1640－1642.

［17］ GIRARD F，VACHON V，LEBEL G，et al.Chemical modification of BacillusthuringiensisCry1Aa toxin singlecysteine mutants reveals the importance of domainⅠstructural elements in the mechanism of pore formation［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2009，1788（2）：575－580.

［18］ VACHON V，PRFONTAINE G，RANG C，et al.Helix 4mutants of the Bacillus thuringiensis insecticidal toxin Cry1Aa display altered pore－forming abilities［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70（10）：6123－6130.

［19］ JIMNEZ－JUREZ N，MUOZ－GARAY C，GMEZ I，et al.Bacillus thuringiensis Cry1Ab mutants affecting oligomer formation are non－toxic to Manduca sextalarvae［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（29）：21222－21229.

［20］ RODRGUEZ－ALMAZN C，ZAVALA L E，MUOZ－GARAY C，et al.Dominant negative mutants of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin function as anti－toxins：Demonstration of the role of oligomerization in toxicity［J］.PLoS One，2009，4（5）：e5545.

［21］ ATSUMI S，INOUE Y，ISHIZAKA T，et al.Location of the Bombyx mori 175kDa cadherin－like protein－binding site on Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin［J］.The FEBS Journal，2008，275（19）：4913－4926.

［22］ RAJAMOHAN F，ALZATE O，COTRILL J A，et al.Protein engineering of Bacillus thuringiensis delta－endotoxin：Mutations at domainⅡof CryIAb enhance receptor affinity and toxicity toward gypsy moth larvae［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1996，93（25）：14338－14343.

［23］ ABDULLAH M A，ALZATE O，MOHAMMAD M，et al.Introduction of Culex toxicity into Bacillus thuringiensis Cry4Ba by protein engineering［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（9）：5343－5453.

［24］ 周子珊.CrylAh蛋白殺蟲特異性分子機制的研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2013：37－38.

［25］ SAMSOMEMEA E，VZQUEZ C，ORTIZ A.Genetic manipulation in Bacillus thuringiensis for strain improvement［J］.Biotechnology Letters，2010，32（11）：1549－1557.

［26］ DE MAAGD R A，WEEMEN－HENDRIKS M，STIEKEMA W，et al.Bacillus thuringiensis delta－endotoxin Cry1C domainⅢcan function as a specificity determinant for Spodoptera exigua in different，but not all，Cry1－Cry1C hybrids［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（4）：1559－1563.

［27］ DE MAAGD R A，KWA M S，VANDER K H，et al.DomainⅢsubstitution in Bacillus thuringiensis delta－endotoxin CryIA（b）results in superior toxicity for Spodoptera exigua and altered membrane protein recognition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62（5）：1537－1543.

［28］ LEE M K，YOUNG B A，DEAN D H.DomainⅢexchanges of Bacillus thuringiensis CryIA toxins affect binding to different gypsy moth midgut receptors［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1995，216（1）：306－312.

（責任編輯：黃曉楠 英文審校：劉源崗）

Structural Comparison of Toxic Core of Cry1A?Type Insecticidal Crystal Proteins

LIU Xiaoping，LIN Yi
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

The 3－D structure of the toxic core for all available 9typical Cry1Aproteins were constructed by the method of homology modeling.The structural differences among different Cry1Aproteins indicated that DomainⅠand DomainⅢwere more conservative than DomainⅡ.Structures of Cry1ADomainⅠwere almost identical except Cry1Aa and Cry1Af which had one more helix.The differences among the Cry1ADomain II were mainly located in loops.Structures of DomainⅢof Cry1Ab，Cry1Ad，Cry1Ae and Cry1Af were consistent，thus these four Cry1Aproteins and the other five were divided into two different subgroups.The results confirm that the key residues and motifs are important for the insecticidal activites of Cry1Aproteins.

Bacillus thuringiensis；Cry1A－type insecticidal crystal proteins；structural differences；structurefunction relationships

S 433

A

1000－5013（2016）04－0465－06

10.11830／ISSN.1000－5013.201604015

2015－10－09

林毅（1976－），男，教授，博士，主要從事伴孢晶體蛋白的基因克隆與信息學的研究.E－mail：lyhxm＠hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目（40601046）；教育部科學技術研究重點項目（211205）；華僑大學中青年教師科研提升資助計劃（ZQN－YX205）