朱國(guó)棟　王勤章

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豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣震蕩特性*

朱國(guó)棟①王勤章②

目的：探討正常成年豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞（Cajal-like interstitial cells）是否有自發(fā)周期性鈣震蕩（calcium oscillation），以期為膀胱興奮性起搏細(xì)胞為Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞這一學(xué)說(shuō)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：運(yùn)用膠原酶V消化法，獲得原代豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，F(xiàn)luo-4AM負(fù)載后的Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化采用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)進(jìn)行記錄，熒光強(qiáng)度的改變代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果：培養(yǎng)后的Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞保持其固有特征，可見(jiàn)胞體為梭形且胞體兩極有兩個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起；培養(yǎng)的Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞有兩類不同的鈣震蕩：一類震幅小而頻率不規(guī)則，另一類震幅大而頻率慢。第二類鈣震蕩與膀胱逼尿肌細(xì)胞的鈣震蕩顯著不同。結(jié)論：與消化道起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）自發(fā)性鈣震蕩類似，成年豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞亦存在自發(fā)鈣震蕩，提示膀胱收縮活動(dòng)的起搏細(xì)胞可能為其中一種類型的膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞。

鈣震蕩；Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞；膀胱；起搏細(xì)胞；激光共聚焦顯微鏡

First-author’s address：Yankuang Group General Hospital，Zoucheng 273500，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.18.001

文獻(xiàn)[1-2]研究證明消化道慢波活動(dòng)的傳導(dǎo)者和起搏細(xì)胞為ICCs，并參與調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號(hào)傳遞。膀胱興奮性的理論研究主要有兩大學(xué)說(shuō)：肌源性和神經(jīng)源性。Smet等[3]首先描述了在人膀胱和豚鼠膀胱中存在形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫熒光特性與ICCs類似的間質(zhì)細(xì)胞，被稱為膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）。由于膀胱Cajal間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使肌源性學(xué)說(shuō)受到更加重視[4-5]。越來(lái)越多的研究表明，逼尿肌以及神經(jīng)與Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞關(guān)系密切，其在電化學(xué)信號(hào)擴(kuò)散、神經(jīng)信號(hào)傳遞中揮重要作用。膀胱興奮異常很大程度與膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞興奮性有關(guān)[6-8]。臨床上常見(jiàn)的膀胱功能障礙，如膀胱過(guò)度活動(dòng)癥（overactive bladder，OAB）、糖尿病性膀胱、神經(jīng)源性膀胱等的共同發(fā)病機(jī)制之一是膀胱逼尿肌興奮性異常[9-11]。由此推測(cè)膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞是膀胱收縮活動(dòng)的起搏細(xì)胞，可能就是控制膀胱興奮性的中心環(huán)節(jié)。膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的功能學(xué)研究尚處于探索階段，未見(jiàn)其為起搏細(xì)胞的報(bào)到。本研究運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)成像技術(shù)記錄膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞和膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣離子濃度變化，探討膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的鈣震蕩特性及相關(guān)生理功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豚鼠10只，1~2 個(gè)月齡，雌雄不限。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、重組干細(xì)胞因子、pluronic F-127、V型膠原酶購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)BS （Gibco公司），fluo-4AM（Molecular Probes，美國(guó)），二甲基亞砜（DMSO，上海生工）。

1.3主要儀器與設(shè)備SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，S/N27709-1462 CO2培養(yǎng)箱，激光共聚焦顯微鏡META.510 Zeiss（德國(guó)蔡司公司）。

1.4方法

1.4.1原代細(xì)胞培養(yǎng)頸部脫臼法處死豚鼠，75%酒精浸泡10 min，無(wú)菌條件下離斷膀胱頸取出膀胱。自膀胱頸部向底部縱行剖開(kāi)并去除膀胱黏膜，解剖顯微鏡下去除漿膜層，在磷酸鹽緩沖溶液中加雙抗（鏈霉素100 mg/L和青霉素100 U/L）浸泡膀胱肌層10 min。將膀胱肌層剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織小塊，以磷酸鹽緩沖溶液漂洗2次，加入膠原酶Ⅴ溶液（10 g/L），37 ℃培養(yǎng)箱中消化，30 min后見(jiàn)組織塊成絮狀，離心管中離心。新鮮配制的DMEM 培養(yǎng)基溶液（含體積分?jǐn)?shù)為0.2的胎牛血清）加入沉淀的細(xì)胞中，吹打均勻后以1×105/mL的密度接種于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，按照50 ng/mL加入重組SCF，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。24 h后觀察接種細(xì)胞，可見(jiàn)膀胱逼尿肌細(xì)胞尚未貼壁，有兩個(gè)突起的胞體為梭形的細(xì)胞貼壁。細(xì)胞換液將未貼壁的逼尿肌細(xì)胞移至另一培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 d后見(jiàn)逼尿肌細(xì)胞貼壁。

1.4.2熒光標(biāo)記將用DMSO溶解fluo-4AM，配制成濃度為1 mmol/L的母液，-20 ℃保存。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天以培養(yǎng)基溶液稀釋母液至終濃度為4 μmol/L，配制成工作液。取出原代細(xì)胞培養(yǎng)皿并移除培養(yǎng)基，PBS液沖洗2次，加入熒光染料Fluo-4 AM（4 μmol/L）1.5 mL，同時(shí)加入20%（w/v）的pluronic F-127促進(jìn)fluo-4AM進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40 min，為使細(xì)胞溫度與室溫同，恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)定性，孵育后室溫下靜放10 min。

1.4.3膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞及膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣震蕩測(cè)定在激光共聚焦顯微鏡下每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)選10個(gè)細(xì)胞作為測(cè)定對(duì)象，以熒光強(qiáng)度變化代表鈣離子濃度變化，以200 ms/張圖片速度進(jìn)行掃描，獲得連續(xù)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化。

1.4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后期分析處理選定細(xì)胞圖像，使用META自帶分析軟件進(jìn)行處理，展示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)圖片并得到每一時(shí)間點(diǎn)的鈣離子熒光強(qiáng)度值，并轉(zhuǎn)為相應(yīng)數(shù)據(jù)。對(duì)每一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析處理進(jìn)行定量分析。細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化以動(dòng)畫形式加以顯示。

1.4.5鈣離子震蕩曲線由SPSS 16.0軟件繪制并分析，熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)用（±s）表示。

2　結(jié)果

2.1體外培養(yǎng)的豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿第2天，倒置顯微鏡下可見(jiàn)胞體為梭形兩極有兩個(gè)突起的貼壁細(xì)胞。根據(jù)其免疫熒光特性和形態(tài)證實(shí)該類細(xì)胞為Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞。2 d逼尿肌細(xì)胞未能貼壁，貼壁能力差，將其轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，3 d后貼壁，倒置顯微鏡下細(xì)胞突起不明顯，呈不規(guī)則形。相同放大倍數(shù)下Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞明細(xì)小于逼尿肌細(xì)胞。

2.2運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)掃描成像技術(shù)觀察膀胱逼尿肌細(xì)胞及Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣震蕩根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化見(jiàn)體外膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣震蕩不規(guī)則，震幅?。?0.61±0.20），顯著低于Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞第二類鈣震蕩震幅（P<0.05）（圖1）。培養(yǎng)的原代膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣震蕩有2種類型：一類頻率快，震幅小（49.69±0.28）且不規(guī)則（圖2），第二類頻率慢（約為3次/min），震幅大（67.56±0.72）而規(guī)則的鈣震蕩（圖3）。鈣離子是胞漿重要成分，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞重要成分Fluo-4 AM染色動(dòng)態(tài)觀察顯示，鈣震蕩起源于胞體，向突足擴(kuò)布（圖4）。

圖1　膀胱逼尿肌細(xì)胞

圖2　膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞震幅小而不規(guī)則鈣震蕩

圖3　膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞震幅大而規(guī)則鈣震蕩

圖4　膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣震蕩動(dòng)態(tài)觀察視覺(jué)圖

3　討論

ICCs是一類特殊的細(xì)胞，分布在消化道平滑肌細(xì)胞和自主神經(jīng)末梢之間，與腸運(yùn)動(dòng)平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)末梢組成一個(gè)基本功能單位。ICCs在消化道內(nèi)有四類不同的分布位置，近年的研究表明，引起胃腸平滑肌自動(dòng)節(jié)律性運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞是位于縱行肌和環(huán)行肌之間的ICCs[12-13]，肌間ICCs可以參與神經(jīng)一肌肉信息傳遞過(guò)程并把信息傳給相鄰的肌細(xì)胞[14]。膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及免疫組化特性與消化道的ICCs相同，在膀胱的分布與ICCs在消化道中分布相似[15]。膀胱逼尿肌在充盈張力牽拉下才會(huì)出現(xiàn)自發(fā)的興奮、收縮，這和胃腸道平滑肌主動(dòng)自發(fā)興奮不同，膀胱充盈時(shí)黏膜上皮在張力牽拉刺激下釋放ATP等物質(zhì)，誘發(fā)膀胱逼尿肌自發(fā)的興奮、收縮，因而認(rèn)為膀胱黏膜下Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞同時(shí)具有起搏和感受器的作用[16-17]。這些提示Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞可具有膀胱收縮起搏細(xì)胞的功能。鈣離子是機(jī)體中最普遍、最重要的第二信使之一，參與包括細(xì)胞分裂、代謝、凝血和受精以及突觸傳遞、激素分泌、肌肉收縮、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理過(guò)程[18]；鈣離子內(nèi)流使慢反應(yīng)細(xì)胞具有四相舒張期自動(dòng)除極的特征[19]。

研究證實(shí)，鈣離子震蕩是ICCs慢波功能為基礎(chǔ)[20]，因而研究膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞是否具有鈣震蕩及震蕩特征對(duì)于了解其生理功能有極其重要的意義。鈣離子熒光劑是Fluo-4AM，通過(guò)培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本研究在激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察記錄膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣離子濃度的變化，發(fā)現(xiàn)膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞存在兩種鈣震蕩類型，提示鈣震蕩不規(guī)則而震幅小的細(xì)胞可能是起到傳導(dǎo)、耦合信息的作用。膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞鈣震蕩規(guī)則而蕩幅度大的可能是膀胱逼尿肌收縮活動(dòng)的起搏細(xì)胞。與ICCs在胃腸道的作用相符合，不同分布位置的細(xì)胞具有不同的功能，這可能與膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞在膀胱的分布有關(guān)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將充實(shí)膀胱運(yùn)動(dòng)調(diào)控的機(jī)制，為以Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞作為潛在靶點(diǎn)治療膀胱相關(guān)疾病的深入研究提供理論依據(jù)。

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Calcium Oscillation Characteristics of Interstitial Cells of Cajal in Guinea Pig Bladder

ZHU Guodong，WANG Qin-zhang.//Medical Innovation of China，2016，13（18）：001-004

Objective：To ascertain the spontaneous and cyclical calcium oscillation in Cajal-like interstitial cells of Cajal in the bladder of adult guinea-pig.Method：The V-type enzyme collagenase was used to separate primary cells from myoblast of the preparation muscle tissue，primary cells were cultured.Using fluo-4 AM dye the Cells.The change of calcium fluorescence intensity was recorded with laser scanning microscope imaging. The changes of the intracellular calcium concentration was on behalf with the Fluorescence intensity.Result：The Cajal-like interstitial cells maintained its inherent characteristics by primary cultivation.We could see that the cell had a spindle cell body with two slender bipolars.In the Cajal-like interstitial cells of bladder：there were 2 different types of spontaneous calcium，small irregular calcium oscillation and large oscillation slow calcium oscillation.The second type of calcium oscillation was completely different from those of smooth muscle cells.Conclusion：We have confirmed the existence of the spontaneous calcium oscillation in the Cajal-like interstitial cells in the bladder of adult guinea-pig，that like the pacemaker cells of interstitial cells of Cajal in the digestive tract.Implying that part of the Cajal-like interstitial cells may be the pacemaker cells of contraction or activity of bladder.

Calcium oscillation；Cajal-like cells；Bladder；Pacemaker cell；Laser scanning confocal microscopy

國(guó)家自然科學(xué)基金（30860281）

①兗礦集團(tuán)有限公司總醫(yī)院山東鄒城273500

②石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

朱國(guó)棟

（2016-03-11）（本文編輯：程旭然）