黃繼川， 徐培智， 彭智平， 于俊紅， 涂玉婷， 楊林香， 吳雪娜, 林志軍

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東省養(yǎng)分資源循環(huán)利用與耕地保育重點實驗室,農(nóng)業(yè)部南方植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，廣州 510640)

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基于稻田土壤肥力及生物學(xué)活性的沼液適宜用量研究

黃繼川， 徐培智， 彭智平*， 于俊紅， 涂玉婷， 楊林香， 吳雪娜, 林志軍

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東省養(yǎng)分資源循環(huán)利用與耕地保育重點實驗室,農(nóng)業(yè)部南方植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，廣州 510640)

沼液; 水稻; 土壤養(yǎng)分; 土壤酶活性; 微生物群落結(jié)構(gòu)

1　材料與方法

1.1供試沼液與水稻品種

早稻和晚稻供試品種均為廣東省農(nóng)科院水稻研究所選育的“黃秀軟占”。沼液pH為8.64、含N 628.1 mg/L、P 78.4 mg/L、K 458.8 mg/L。供試氮肥為尿素、磷肥為過磷酸鈣、鉀肥為氯化鉀。

1.2供試土壤理化性質(zhì)

試驗于2013年在惠州市博羅縣湖鎮(zhèn)進(jìn)行，試驗前采集水稻田0—20 cm耕層土壤測定土壤養(yǎng)分含量與酶活性。其中，有機質(zhì)2.23%、堿解氮115.22 mg/kg、有效磷56.16 mg/kg、速效鉀78.41 mg/kg、pH 5.03; 蔗糖酶活性3.01 Sucrose g/(kg·d)、脲酶活性184.19 NH3-N mg/(kg·d)、酸性磷酸酶活性3.81 phenol g/(kg·d)

1.3試驗設(shè)計

試驗設(shè)7個處理，分別為: 不施肥(CK); 常規(guī)施肥(N ∶P2O5∶K2O=1 ∶0.40 ∶0.87，施氮量為165 kg/hm2，以下簡稱CF); 施沼液200(BS200)、400(BS400)、600(BS600)、800(BS800)、1000 m3/hm2(BS1000)。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，小區(qū)面積40 m2，小區(qū)間起30 cm寬、30 cm高的田埂并用尼龍膜阻隔，小區(qū)之間保護(hù)行寬2 m，保護(hù)行不施肥。水稻移栽前(早稻4月7日、晚稻8月7日)進(jìn)行沼液灌施，一周后移栽水稻秧苗。在水稻收獲期(早稻7月18日，平均氣溫30.1℃; 晚稻11月20日，平均氣溫19.3℃)每個小區(qū)采集0—20 cm土層10個樣點混勻作為該小區(qū)土樣，一部分自然風(fēng)干供土壤理化性質(zhì)測定，一部分在-20℃保存，1周內(nèi)測定土壤酶活性，同時將同一個處理3個小區(qū)的剩余鮮土樣混勻用無菌自封保鮮袋保存于-80℃供PCR-DGGE分析土壤微生物群落。

1.4分析方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性檢測土壤有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、pH按照魯如坤主編的《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》測定[15]; 土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法[16]; 脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]; 酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法檢測[17]。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0和Excel 2003軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Quantity One軟件對DGGE圖譜的泳道和條帶進(jìn)行識別，分析不同樣品之間可能存在的聯(lián)系。

用Sorenson配對比較相似性系數(shù)(pairwise similarity coefficient，Cs)，比較不同樣品DGGE指紋圖譜的相似性。

Cs=2j/(a+b)

式中， a、b表示兩個比較對象中的DNA條帶數(shù)目，j表示a和b中相同的條帶數(shù)量。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、pielou均勻度指數(shù)(J)、物種豐度(S)等指標(biāo)被用來比較各個樣品的微生物多樣性。計算公式如下:

J=H/Hmax=H/lnS

式中，pi是某個樣品中單一條帶的強度在該樣品中的所有條帶總強度中所占的比率; S是某個樣品中所有條帶數(shù)目總和。

2　結(jié)果與分析

2.1施用沼液對稻田土壤肥力的影響

2.2施用沼液對稻田土壤酶活性的影響

表1　收獲期土壤理化指標(biāo)

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示同種水稻不同處理間差異達(dá)5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersaresignificantlydifferentamongtreatmentsofthesamericetypeat5%level.

表2　施用沼液稻田土壤酶活性

注(Note): 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示同種水稻不同處理間差異達(dá)5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersaresignificantlydifferentamongtreatmentsofthesamericetypeat5%level.

從電泳結(jié)果(圖1)可以看出，無論早稻和晚稻，各個處理間條帶數(shù)目，條帶的亮度和遷移距離都存在一定差異，且晚稻差異較早稻明顯。各樣品相似系數(shù)如表3所示，與CK處理相比，早稻和晚稻各處理均隨著沼液用量的增加相似系數(shù)逐漸下降，說明隨沼液用量的增加微生物群落結(jié)構(gòu)與CK之間的差異變大，與CF處理之間的相似系數(shù)變化跟CK相似，隨著沼液用量的增加相似系數(shù)降低。其中CF處理和BS200處理的相似度早稻為90.0%，晚稻為80.6%，這兩個處理的微生物群落結(jié)構(gòu)相似程度最高; 而早稻BS400與BS1000 處理的相似度最低，為65.8%，晚稻CF與BS1000處理相似度最低，為38.1%。

圖1　稻田土壤樣品細(xì)菌16S rDNA 片段PCR產(chǎn)物DGGE圖譜(A: 早稻; B: 晚稻)Fig.1　DGGE profile of amplified 16S rDNA fragments from paddy soil samples of early rice(A)and late rice(B)

稻作季節(jié)Riceseason處理TreatmentCKCFBS200BS400BS600BS800BS1000早稻CK100EarlyriceCF88.9100BS20085.590.0100BS40088.287.685.6100BS60076.380.580.579.1100BS80076.378.480.680.885.2100BS100067.867.868.365.869.569.6100晚稻CK100.0LatericeCF74.3100.0BS20074.180.6100.0BS40060.762.463.1100.0BS60073.967.668.767.3100.0BS80069.667.268.668.673.7100.0BS100042.938.139.453.350.155.5100.0

此外，與早稻相比，晚稻施沼液處理與CK和CF之間的相似系數(shù)呈下降趨勢，而且施用沼液的處理之間相似系數(shù)也呈下降趨勢，說明連續(xù)施用沼液對稻田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響作用具有一定的累積疊加效應(yīng)。

如表4所示，早稻土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)(H′)和辛普森指數(shù)(D)以及均勻度指數(shù)(J′)總體隨沼液用量的增加而提高，至BS800處理最高，繼續(xù)增加沼液用量后又下降，而物種豐度(S)以BS1000最高，CK最低。與CK相比，CF處理能夠提高土壤細(xì)菌多樣性，而施用沼液處理微生物多樣性較常規(guī)處理進(jìn)一步提高。晚稻土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化與早稻相似，隨沼液用量的增加多樣性指數(shù)(H′)和辛普森指數(shù)(D)提高，在BS600處理最高，均勻度指數(shù)(J′)在CF處理最高，繼續(xù)增加沼液用量多樣性指數(shù)(H′)和辛普森指數(shù)(D)以及均勻度指數(shù)(J′)下降，在BS1000處理最低。說明適量沼液有利于改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而過量施用沼液則降低了土壤微生物的多樣性指數(shù)、辛普森以及均勻度指數(shù); 物種豐度(S)以BS600處理最高，其次為BS1000處理，而CK最低。

通過聚類分析表明，早稻CF和BS200處理聚為一類，而CK處理和BS400聚為一類，BS600和BS800聚為一類，而BS1000單獨為一類。與早稻結(jié)果相似，晚稻除BS1000處理以外，沼液施用量相近的處理首先聚類，而BS1000處理單獨聚為一類，與其他處理土壤微生物群落的差異最大，說明沼液用量的增加微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，至最大用量時微生物群落與其他處理土壤微生物群落差異最大。

表4稻田土壤微生物多樣性分析

Table4Microbialdiversitiesofpaddysoil

稻作季節(jié)Riceseason處理TreatmentH'DJ'S早稻CK2.8360.8820.75443EarlyriceCF2.9970.9020.78745BS2003.0930.9100.80347BS4003.0090.9020.77349BS6003.0990.9120.81046BS8003.1760.9200.81250BS10002.9490.8820.75051晚稻CK3.1390.9260.81148LatericeCF3.2830.9370.83152BS2003.3160.9360.82855BS4003.1970.9280.81351BS6003.3580.9390.82060BS8003.0670.9070.76954BS10002.9140.8850.71858

2.4土壤酶活性、微生物群落與土壤理化因子的主成分分析

對土壤酶活性、微生物群落以及土壤理化等肥力因子進(jìn)行主成分分析(表5)。結(jié)果表示，早稻主成分分析前三個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為89.208%(大于85%)，根據(jù)主成分分析原理，這三個主成分能完全反映土壤系統(tǒng)全部的變異信息。其中第一個主成分方差貢獻(xiàn)率達(dá)到43.171%，在全部因子中占主要地位，代表了土壤pH、有機質(zhì)和堿解氮、有效磷和速效鉀以及微生物物種豐度等指標(biāo)的信息，主要反映土壤系統(tǒng)理化性質(zhì)和微生物豐度方面的綜合指標(biāo)(表6); 第二主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到36.963%，在土壤肥力系統(tǒng)中占次要地位，主要代表了土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)方面的信息; 第三主成分方差貢獻(xiàn)率為9.073%，主要代表了土壤有機質(zhì)和脲酶的信息。

對晚稻土壤系統(tǒng)肥力因子的主成分分析表明，前三個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為92.462%(大于85%)(表5)。第一主成分方差貢獻(xiàn)率為62.792%，在土壤肥力系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位，除脲酶以外其他指標(biāo)在第一主成分中均有較高的載荷，因此第一主成分集中了絕大部分指標(biāo)的信息，代表了土壤的整體綜合肥力水平(表6); 第二主成分方差貢獻(xiàn)率為20.975%，在肥力系統(tǒng)中也占有較為重要的地位，主要代表了土壤蔗糖酶、脲酶、微生物群落結(jié)構(gòu)方面的信息，反映了土壤系統(tǒng)中的生理生化過程; 第三主成分方差貢獻(xiàn)率為8.695%，代表了土壤脲酶活性與微生物物種豐度方面的信息。

3　討論

沼液具有提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[4,19]、提高土壤酶活性、改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[11-12]的效果。稻田施用沼液可提高土壤有機質(zhì)、易氧化有機碳、腐植酸碳和胡敏酸碳等營養(yǎng)物質(zhì)含量[4,13,19]，這與沼液中含有豐富的有機物質(zhì)有關(guān)。本試驗中，隨沼液施用量的增加稻田土壤有機質(zhì)含量提高，與CK相比早稻和晚稻有機質(zhì)提高不顯著，但與CF處理相比，早稻BS600至BS1000m3/hm2、晚稻施BS800和BS1000施沼液處理均表現(xiàn)為顯著提高。沼液含有豐富的有機物質(zhì)，但大多易迅速氧化分解而損失，而伴隨大量氮肥施入促進(jìn)了非自養(yǎng)微生物對有機碳的消耗，導(dǎo)致有機質(zhì)累積量下降[20]。本試驗隨沼液施入氮素量大幅的增加，加速了土壤中非自養(yǎng)微生物活性，加劇了碳素消耗，導(dǎo)致隨沼液投入的易氧化有機物質(zhì)大量分解損耗，對土壤有機質(zhì)的提升幅度降低，因此，與CK處理相比有機質(zhì)提升并不顯著。而CF處理由于氮素投入的同時無有機物的投入，導(dǎo)致土壤中原有碳素的消耗，從而引起土壤有機質(zhì)下降，造成了CF處理有機質(zhì)在早稻較BS600至BS1000處理，在晚稻較BS800和BS1000處理顯著下降的現(xiàn)象。

表5　土壤主成分特征值

表6　土壤主成分的規(guī)格化特征向量

土壤pH受母質(zhì)的影響很大，水肥管理也會對土壤pH產(chǎn)生影響[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，早稻土壤pH隨沼液用量的增加而下降，與唐華等[13]的研究結(jié)果相似; 而晚稻土壤pH則隨沼液用量的增加而增加，與史一鳴的研究結(jié)果相似[23]，由于晚稻土壤為連續(xù)兩季施用沼液，總體表現(xiàn)為施用沼液后pH呈上升趨勢，這與沼液本身為堿性有關(guān)。CK和CF處理晚稻土壤pH明顯下降，是否與早稻和晚稻土壤溫度變化導(dǎo)致土壤中鹽基飽和度或土壤膠粒上吸附性離子的解離度改變有關(guān)有待進(jìn)一步研究，而晚稻施沼液BS600至BS1000m3/hm2處理pH與早稻較為接近，可能與沼液中有機物質(zhì)含量的增加提高了土壤的緩沖性能而導(dǎo)致土壤pH相對趨于穩(wěn)定有關(guān)。本試驗施用沼液的處理中早稻產(chǎn)量以BS800最高(4925kg/hm2)，其次為BS1000和BS600，分別為(4685和4451kg/hm2)，晚稻以BS800最高，其次為BS600，分別為5040和4633kg/hm2，而BS1000處理產(chǎn)量為3876kg/hm2，較BS600和BS800處理顯著下降(產(chǎn)量數(shù)據(jù)另文發(fā)表)，就水稻產(chǎn)量而言，沼液用量在800m3/hm2時可獲得較高的產(chǎn)量。

沼液不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)還含有豐富的生物活性物質(zhì)，適量施用沼液能夠提高土壤酶活性，促進(jìn)土壤內(nèi)部生理生化過程的變化，諸多報道發(fā)現(xiàn)施用沼液提高土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性[7,11-13]，但沼液用量過高會降低土壤酶活性[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，早稻與晚稻土壤脲酶和蔗糖酶活性均隨沼液用量的增加呈先升高后下降的趨勢; 土壤酸性磷酸酶活性在早稻規(guī)律性不明顯，而晚稻隨沼液用量增加而提高，說明施用沼液總體改善了土壤酶活性，這可能與沼液中含有大量的酶對土壤酶有增加的作用，而且沼液中易分解有機物質(zhì)可為各種酶提供豐富的底物從而提高了酶活性有關(guān)[26]。此外，早稻試驗土壤酶活性普遍較晚稻高，可能與早稻土壤溫度較晚稻高有關(guān)，有待進(jìn)一步研究驗證。

土壤有機質(zhì)、pH和礦質(zhì)養(yǎng)分以及土壤酶和微生物主導(dǎo)的生理生化過程對土壤肥力起到重要作用。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，在早稻第一主成分累積方差貢獻(xiàn)率最大，其中土壤礦質(zhì)養(yǎng)分、有機質(zhì)、pH以及微生物豐度具有較大載荷，說明土壤礦質(zhì)養(yǎng)分和有機質(zhì)、pH以及微生物豐度為影響土壤綜合肥力的主導(dǎo)因子，主要以土壤理化因子和微生物豐度反映土壤的綜合肥力; 第二主成分中土壤酶活性和微生物多樣性指數(shù)均具有較大載荷，主要反映了土壤生物學(xué)活性方面信息，雖然不能代表土壤綜合肥力，但由土壤酶及微生物主導(dǎo)的生理生化過程對土壤肥力具有明顯影響。在晚稻的第一主成分中除土壤脲酶以外其他指標(biāo)均具有較高的載荷，說明除脲酶以外的各個指標(biāo)均對土壤綜合肥力產(chǎn)生重要的影響，代表了土壤系統(tǒng)的綜合肥力水平，第二主成分中蔗糖酶、脲酶以及微生物多樣性指數(shù)具有較高的載荷，再次說明了土壤酶活性和微生物群落所主導(dǎo)的土壤生理生化過程在土壤肥力方面的重要性。此外, 通過早稻和晚稻試驗數(shù)據(jù)主成分分析對比發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施用沼液后除脲酶外其他指標(biāo)在第一主成分因子中均具有較高的載荷，土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶以及微生物多樣性對土壤肥力的貢獻(xiàn)率與早稻相比均得到提高，說明連續(xù)施用沼液提高了各指標(biāo)對土壤肥力的影響程度，尤其是提高了土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶以及微生物群落在土壤肥力中的貢獻(xiàn)率，施用沼液在培肥稻田土壤方面具有較好的應(yīng)用價值。

4　結(jié)論

1)土壤有機質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀的含量隨沼液施用量的增加明顯提高，且連續(xù)施用具有一定的累積疊加效應(yīng); 土壤pH在短期(1茬)內(nèi)表現(xiàn)為隨沼液用量增加而降低，連續(xù)施用沼液2茬，施用量在600至1000m3/hm2時土壤pH得到改善。

3)施用適量沼液能夠提高土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，過多則效果降低。連續(xù)施用沼液對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響具有累積疊加效應(yīng)。早稻和晚稻分別以施用800和600m3/hm2較為適宜，早稻1000m3/hm2以上、晚稻800m3/hm2微生物群落多樣性下降。

4)綜合考慮稻田土壤理化肥力因子、土壤酶活性以及微生物群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量，以及連續(xù)施用沼液的疊加效應(yīng)，本研究條件下的沼液推薦用量在600到800m3/hm2之間。

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Biogas slurry use amount for suitable soil nutrition and biodiversity in paddy soil

HUANG Ji-chuan, XU Pei-zhi, PENG Zhi-ping*, YU Jun-hong, TU Yu-ting, YANG Lin-xiang, WU Xue-na, LIN Zhi-jun

(InstituteofAgriculturalResourcesandEnvironment,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences/GuangdongKeyLaboratoryofNutrientCyclingandFarmlandConservation/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizerinSouthRegion,MinistryofAgriculture,Guangzhou510640,China)

【Objectives】Biogas slurry is one of the byproducts of breeding industry, full of organic and inorganic nutrients good for crop growth, and must be recycled from point of ecological and economic sustainability. The effects of biogas slurry on the soil fertility and biological properties of paddy soil, and the suitable use amount for healthy soil ecosystem were studied in this paper. 【Methods】Field experiments were carried out in early rice and late rice in Boluo County, Guangdong Province in 2013. The experiment included two controls(no fertilizer and chemical fertilizer), and five levels of biogas slurry treatments(200, 400, 600, 800 and 1000 m3/hm2). The soil nutrient contents and enzyme activities in paddy soil were analyzed, and the soil microbial diversities and microbial structures were studied by PCR-DGGE method. 【Results】 With biogas slurry application increased, the content of soil organic matter, available N，available P and available K were enhanced, continuous application of biogas slurry showed accumulation effects. Soil pH was reduced in early rice experiment and enhanced in late rice experiment with the increase of biogas slurry application. The activities of soil sucrase, urease and acid phosphatase were enhanced by the application. The highest soil microbial diversities indexes were obtained when the biogas slurry applied amount was 800 m3/hm2in early rice and 600 m3/hm2in late rice. The similarity coefficient of soil microbial structure was decreased with biogas slurry dosage increased; the differentiation of microbial structure among treatments in late rice season was higher than in early rice season. Principal component analysis showed that the first principal component in early rice was the information of physicochemical properties and microbial abundance, while that in late rice was the soil physicochemical properties, soil microbial diversities and enzyme activities except urease. Biogas slurry application affected paddy soil physicochemical properties, especially biological activity after continuous use in early and late rice. 【Conclusion】Application of biogas slurry increases the contents of soil organic matter, available N, P and K, and improves soil enzyme activities, microbial diversities and microbial structures in application range of biogas slurry 400-800 m3/hm2. Comprehensively considering the soil fertility and biological health, as well as the accumulation effects of continuous application, 600-800 m3/hm2of biogas slurry is suggested for rice production in paddy soil ecosystem.

biogas slurry; rice; soil nutrient; soil enzyme activities; microbial structures

2014-11-13接受日期: 2015-08-21網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-09-29

廣東省科技計劃重點項目“廣東省生態(tài)農(nóng)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研究”(2012A020100003)； 廣東省科技計劃項目“廣東省新型肥料與高效施肥工程技術(shù)研究中心建設(shè)(2014B090904068)”資助。

黃繼川(1981—)，男，廣西桂林人，博士研究生，副研究員，主要從事土壤微生物方面的研究。

Tel: 020-38469763， E-mail: huangkuang_2002@aliyun.com。*通信作者Tel: 020-38469763, E-mail: ytifei@aliyun.com

S141; S506.2

A

1008-505X(2016)02-0362-10