智一鳴， 陳 芳， 劉曉曼， 肖 凱

(河北農業(yè)大學農學院，河北保定 071001)

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小麥生長素響應因子TaARF6轉基因煙草植株分子鑒定

智一鳴， 陳 芳， 劉曉曼， 肖 凱*

(河北農業(yè)大學農學院，河北保定 071001)

【目的】生長素響應因子(ARF)在介導生長素信號傳遞和調控下游生長素響應基因的表達中發(fā)揮著重要功能。本文旨在以在富集豐磷特異表達基因的小麥根系cDNA差減文庫中鑒定的1個ARF類別的家族成員TaARF6為基礎，對該基因cDNA序列、分子特征、不同供磷水平下該基因在根、葉中表達模式及遺傳轉化TaARF6對豐磷和缺磷條件下植株形態(tài)的影響進行較全面研究，闡明該小麥生長素響應因子基因介導不同供磷水平下對植株生長特性的影響?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W工具預測TaARF6編碼蛋白特征; 采用溶液培養(yǎng)法培養(yǎng)豐、缺磷處理小麥幼苗，采用半定量RT-PCR技術鑒定TaARF6在豐、缺磷處理下的表達特征。采用DNA重組技術構建將TaARF6編碼閱讀框融合至表達載體中的表達質粒，利用農桿菌介導的遺傳轉化法建立超表達TaARF6轉基因煙草植株。采用瓊脂培養(yǎng)和溶液培養(yǎng)法，培養(yǎng)豐、缺磷不同供磷水平下野生型植株和轉基因煙草植株，進而利用常規(guī)分析方法鑒定不同磷水平下植株長勢、根系和莖葉生物量和植株根葉形態(tài)及性狀?！窘Y果】1)TaARF6編碼生長素響應因子(ARF)型轉錄因子，編碼蛋白中含有ARF家族成員具有的保守結構域。該基因在氨基酸水平上與源于短柄草BdARF6和源于水稻的OsARF6具有高度同源特征。表達分析表明，TaARF6在根、葉中均呈典型低磷下表達下調、復磷后表達再度回升模式，表明該基因表達受到外界供磷水平的調節(jié)。2)遺傳轉化結果表明，在正常生長和低磷逆境下，與野生型植株相比，轉基因煙草株系幼苗和植株形態(tài)明顯增大。3)豐、缺磷不同供磷水平下，與未轉化的野生型(WT)對照植株相比，轉基因系(Line3 和Line5)植株幼苗和植株根系、莖葉和單株鮮、干重均較野生型顯著增加。此外，與WT相比，轉基因系植株根系數量增多、主側根長度、根體積、葉面積和根冠比增加。【結論】TaARF6編碼典型的生長素響應因子，其編碼蛋白具有生長素響應因子特有結構域。TaARF6對環(huán)境中的低磷脅迫逆境能產生明顯應答。上調表達TaARF6基因，具有增加植株根、葉鮮、干重和改善根葉及植株形態(tài)的生物學功能。本研究表明，通過對植株體內生長素響應基因的轉錄調控，TaARF6在介導植株不同供磷水平下的根葉形態(tài)建成和干物質累積過程中發(fā)揮著重要作用。

小麥(Triticum aestivumL.); 生長素響應因子; 分子特征; 遺傳轉化; 根葉生長

genetictransformation;rootandleafgrowth

生長素是植物生長發(fā)育的重要激素類物質，生長素信號與植株頂端優(yōu)勢、根系側根發(fā)生、維管組織分化等密切相關[1-2]。在分子水平上，部分特定轉錄因子被生長素活化后，進入細胞核啟動下游生長素應答基因發(fā)生特異性表達。目前證實，與生長素信號轉導相關的轉錄因子，可歸屬于早期應答和晚期響應兩個類別。其中，早期應答生長素信號的轉錄因子基因，通過活化已編碼蛋白或改變自身表達水平，快速激活下游生長素應答基因; 晚期響應轉錄因子基因則表現(xiàn)為對生長素呈長期響應的特點，能在較長時間內調控下游基因轉錄，維持生長素持續(xù)生理效應[3]。

生長素響應因子(auxinresponsefactor,ARF)基因在植株體內以家族形式存在，是植物種屬中參與生長素信號傳遞的重要轉錄因子。研究表明，與生長素(AUX/IAA)活化蛋白互作、以鈍化形式存在的ARFs，感受生長素信號后，因互作蛋白被泛素連接酶降解而轉化為活化狀態(tài)。活化后的ARFs進一步聚合成同源二聚體，與生長素信號早期應答基因啟動子中生長素響應元件AuxRE(基序TGTCTC)特異互作，啟動下游生長素響應基因轉錄[4-5]。在蛋白特征上，ARF轉錄因子通常在N-末端含有保守DNA結合域(DNA-bindingdomain，DBD)，在蛋白中部含有轉錄激活區(qū)(AD)或抑制區(qū)(RD)，在C-末端含有與Aux/IAAs結合蛋白類似的二聚體化保守域[6-7]。

近年來，在擬南芥和水稻中分別鑒定了23和25個歸屬于ARF轉錄因子的基因家族成員[8-9]。此外，不少學者對擬南芥和水稻ARF家族成員的表達特征和生物學功能進行了研究[10-14]。但迄今有關小麥種屬中ARF家族成員鑒定、分子特征分析和功能研究尚少見報道。作者通過對前期構建的富集豐磷特異表達基因的根系cDAN差減文庫測序和序列比對分析，發(fā)現(xiàn)了1個與短柄草ARF家族成員BdARF6高度同源的表達序列標簽(EST)。本文以該EST為基礎，對該EST對應基因(TaARF6)的分子特征、在豐、缺磷不同供磷水平下表達模式及該基因遺傳轉化對植株形態(tài)特征的影響進行了研究。旨在從ARF調控下游基因轉錄角度，深化對小麥應答生長素機理的認識，為今后小麥遺傳改良提供理論依據。

1　材料與方法

1.1TaARF6序列的獲得

筆者前期以小麥品種石新828為材料，構建了富集豐磷特異表達基因的根系cDNA差減抑制雜交(SSH)文庫。通過對文庫中部分克隆測序及序列比對分析，獲得1個與短柄草生長素響應因子類轉錄因子基因BdARF6(B. distachyon，登錄號XM_003575314)高度同源的表達序列標簽(EST)?；谏L素響應因子在調控植株生長發(fā)育及逆境下細胞分裂中發(fā)揮著重要功能，作者對該EST對應基因在NCBI的GenBank中進行查找，獲得了與該EST對應的全長cDNA(登錄號AK334329)。經文獻檢索，有關該小麥基因分子特征和生物學功能尚未報道，本文將其命名為TaARF6。

1.2TaARF6的分子特征及與植物種屬同源蛋白的多重比對分析

采用DNAStar軟件，鑒定TaARF6編碼氨基酸序列、編碼蛋白分子量和等電點。以TaARF6蛋白序列為基礎進行BLATx分析，獲得該蛋白保守域及短柄草中同源蛋白BdARF6和水稻同源蛋白OsARF6序列。采用DNAStar軟件中MegAlign多重比對工具，進行TaARF6與上述蛋白序列比對分析。1.3TaARF6在不同供磷水平下表達分析

參照Sun等[15]的方法，采用MS營養(yǎng)液培養(yǎng)小麥(cv.石新828)幼苗至三葉期。然后，將幼苗由正常生長[Pi1.2mol/L(正常含磷)]轉移至將磷(Pi)降低至0.012mol/L的MS營養(yǎng)液中進行低磷脅迫處理。在處理后6、12和24h，收獲根、葉樣本，以處理前(0h)根、葉作對照，研究TaARF6在正常生長和低磷脅迫下的表達特征。此外，另將部分低磷處理24h后的幼苗再度轉移至含有正常含磷量(Pi1.2mol/L)的MS營養(yǎng)液中進行恢復生長，在恢復后6、12和24h后收獲根、葉樣本，用于研究TaARF6對恢復正常供磷后的響應特征。

采用TRIzol試劑盒提取樣本總RNA，用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄獲得cDNA產物。采用半定量RT-PCR，鑒定TaARF6在不同供磷水平下的表達特征，用于擴增供試基因的特異引物為5′-TCAACCGACTGCAGCGTTCGT(正向)和5′-TTAGAGGCCCTACATCAACAGC(反向)。以小麥組成型表達基因tubulin對TaARF6表達產物進行均一化，擴增tubulin引物為5′-GTTTGAGACCTTCAACACCCC(正向)和5′-GTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC(反向)。PCR擴增參照Guo等的方法[16]進行。1.4TaARF6表達載體構建及煙草遺傳轉化

以TaARF6cDNA克隆質粒為模板，擴增該基因編碼閱讀框，引物為5′-GTAGATCTGATGAATCTCTCGCCGTCCG(正向，引入BglII限制性切點)和5′-TTTGGTCACCTTCACGAACGCTGCAG(反向，引入BstEII切點)，擴增產物用NcoI和BstEII雙酶切后融合至雙元表達載體pCAMBIA3301中。參照Sun等[15]的方法，采用農桿菌介導法遺傳轉化煙草(cv.Wisconsin38)，獲得超表達TaARF6轉基因煙草植株。以獲得的T1轉基因系為材料，用TRIzol提取正常水培幼苗根系總RNA，利用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄，以獲得的反轉錄產物cDNA為模板，采用半定量RT-PCR技術，鑒定各轉基因系中TaARF6的表達水平，其中，采用的引物為5′-GATGAATCTCTCGCCGTCCG(正向)和5′-TTCACGAACGCTGCAG(反向)，以煙草組成型表達延伸因子1a(elongationfactor1a)基因NtEF1a(登錄號D63396)作為檢測各供試轉基因系中TaARF6的內標，擴增該內標基因正向引物為5′-GCTCCCACTTCAGGATGTGTA，反向引物為5′-ACACGACCAACAGGGACAGT。

1.5正常生長及低磷處理后轉基因煙草的根葉鮮、干重及形態(tài)測定

將獲得的7個遺傳轉化TaARF6的煙草株系在生長室內繁殖至T3代，以2個具有較高TaARF6表達的轉基因株系(Line3和Line5)和野生型(WT)植株為材料，在含有正常供磷(Pi1.2mol/L)和低磷(Pi0.05mol/L)瓊脂培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)幼苗，研究不同供磷水平下轉基因株系幼苗根葉鮮、干重及根系數量、 根長、 葉面積、 根冠比。在豐、缺磷條件下, 各供試材料幼苗的培養(yǎng)時間分別為10和15d。此外，采用含有上述豐、缺磷含量的MS營養(yǎng)液水培各供試材料植株，研究不同供磷水平下成株期根葉鮮、干重，根系體積，葉面積和根冠比特征。在豐、缺磷條件下各供試材料植株培養(yǎng)的時間分別為3和4周。溶液培養(yǎng)期間，每3d更換一次營養(yǎng)液，微型氣泵供氣。

處理完成后，對正常培養(yǎng)和低磷處理后幼苗和植株進行形態(tài)觀察并照相記錄。采用常規(guī)法測定幼苗和植株根葉鮮、干重，通過對根葉鮮、干重分別求和獲得單株鮮、干重，通過將根系干重與莖葉干重比值計算根冠比。此外，查數10株幼苗根數，獲得瓊脂培養(yǎng)條件下單株根數，用直尺量取各條根長求和后得到幼苗根長。用葉面積儀測定5株葉面積，求和獲得單株葉面積值。采用排水法測定溶液培養(yǎng)植株根系體積，測定樣本為5株。同樣采用葉面積儀測定上述植株的單株葉面積。上述各性狀測定均進行3次重復。

1.6數據處理

采用統(tǒng)計學分析軟件SAS(SPSS13.0)，對不同處理野生型及轉基因植株根系、莖葉和單株鮮、干重、根數、根長、根體積、根冠比和葉面積進行顯著性測定和標準差分析。

2　結果與分析

2.1TaARF6的分子特征

TaARF6cDNA全長為3655bp，開放閱讀框2328bp，編碼775 個氨基酸(aa)。該基因編碼蛋白分子量為85.58kD，等電點(pI)為6.20。在N-端aa1至aa125區(qū)間，含有1個DNA結合區(qū); 在aa129至aa235區(qū)間，含有1個保守B3_DNA區(qū); 在aa258至aa347區(qū)間，含有1個保守生長素響應區(qū)。上述特征表明，TaARF6是小麥生長素響應因子(ARF)家族中的重要成員。

通過BLAST工具進行同源查找，獲得了與TaARF6高度同源源于短柄草的ARF成員BdARF6和源于水稻的ARF成員OsARF6。多重比對分析表明，在氨基酸水平上，TaARF6與BdARF6和OsARF6具有較高同源性(一致性分別為87.4%和81.5%)(圖1)。表明TaARF6在植株體內可能執(zhí)行與OsARF6與BdARF6類似的生物學功能。

2.2TaARF6在不同供磷水平下的表達特征

采用半定量RT-PCR技術，檢測了小麥根、葉中TaARF6在不同供磷水平下的表達特征。結果表明，TaARF6在根、葉中的表達特征相似，表現(xiàn)為在正常生長(0h)條件下，該基因在根、葉中均呈較高水平表達; 低磷處理后，該基因表達下調，呈隨著低磷處理時間延長其表達水平也隨之不斷降低的特征; 將低磷處理24h后植株再度轉入至正常供磷水平進行恢復生長后，該基因在根、葉中的表達再度上調，且隨恢復進程表達水平不斷增高(圖2)。表明TaARF6通過對環(huán)境中磷(Pi)水平產生明顯應答，在介導植株應答環(huán)境中供磷水平中可能發(fā)揮著重要作用。

圖1　TaARF6與短柄草BdARF6及水稻OsARF6的多重比對結果Fig.1　The alignment results among TaARF6, BdARF6 and OsARF6

圖2　TaARF6在不同供磷水平下的表達模式Fig. 2　The expression patterns of TaARF6 under various Pi-supply conditions

[注(Note): 0h代表低磷處理前正常供磷水平0hrepresentsthenormalPlevelbeforethePi-deficienttreatment; 6h、12h和24h表示低磷處理后時間6h, 12hand24hstandforthetimepointsafterthePi-deficienttreatment;R6h、R12h和R24h表示低磷處理24h再度恢復至正常供磷后的時間R6h,R12handR24hstandforthetimepointsunderarecoveryPitreatmentaftera24hofPi-deficienttreatment.]

2.3遺傳轉化TaARF6轉基因煙草植株分子鑒定

采用DNA重組技術，構建了將TaARF6編碼閱讀框融合至雙元表達載體pCAMBIA3301中的表達質粒，其表達框示意圖如圖3A所示。采用農桿菌介導煙草葉圓盤轉化法，建立了遺傳轉化TaARF6的轉基因煙草植株。對各轉基因系中TaARF6的表達水平分析表明，在7個轉基因系中，TaARF6的表達程度不同，以轉基因系4較高，轉基因系3、5、2和6次之，轉基因系1和7較低(圖3B)。此外，在野生型(WT)植株中也檢測到TaARF6同源片段(圖3B)，表明煙草中存在著TaARF6同源基因。

2.4過表達TaARF6轉基因煙草在兩種磷處理下的形態(tài)特征

采用不同含磷水平(正常供磷，Pi1.2mol/L和低磷處理，Pi0.05mol/L)瓊脂斜面培養(yǎng)轉基因系Line3和Line5及野生型(WT)植株，各轉基因系和WT在不同供磷處理后的幼苗形態(tài)如圖4A所示。結果表明，在正常供磷水平和低磷處理條件下，與WT相比，轉基因系Line3和Line5的幼苗長勢均明顯增強，根系和莖葉形態(tài)呈不同程度增大特征。采用與上述相同含磷水平的豐磷和低磷MS營養(yǎng)液對上述轉基因系及WT進行溶液培養(yǎng)處理，各供試材料植株根、葉形態(tài)特征結果與上述瓊脂培養(yǎng)幼苗的結果相似(圖4B)。

圖3　融合TaARF6表達框示意圖及煙草轉基因系中TaARF6表達水平鑒定Fig.3　The diagram of expression cassette integrated TaARF6 and the TaARF6 expression levels in the transgenic tobacco plants

[注(Note):A-融合TaARF6表達框示意圖DiagramoftheexpressioncassetteintegratedTaARF6;B-煙草轉基因系中TaARF6表達水平ExpressionlevelsofTaARF6inthetobaccotransgeniclines.WT為野生型WTstandsforthewildtype;Line1至Line7為遺傳轉化TaARF6的煙草轉基因系Line1toLine7meanthetransgeniclinesintegratedTaARF6.]

2.5過表達TaARF6轉基因煙草在兩種磷處理下的根葉干重、根系形態(tài)、葉面積和根冠比

對不同磷水平下瓊脂培養(yǎng)和溶液水培TaARF6轉基因系(Line3和Line5)及WT根系、莖葉和單株干重進行了測定。結果表明，與前已述及的植株形態(tài)相似，在兩種供磷水平下，與WT相比，轉基因系Line3和Line5的根系、莖葉和單株鮮、干重均顯著增加(圖5、 圖6)。上述結果表明，遺傳轉化TaARF6具有促進植株各器官生長和增加植株鮮、干重功能。轉基因系植株在低磷逆境下較對照植株表現(xiàn)出明顯改善的植株形態(tài)和較高根葉鮮、干重，表明TaARF6具有增強植株抵御低磷逆境的能力。這可能與其增強植株應答生長素能力和由此誘導生長素響應基因表達進而促進細胞分裂有關。

進一步對正常生長和低磷處理下瓊脂培養(yǎng)和溶液水培的TaARF6轉基因系和WT根系形態(tài)和單株葉面積進行了測定。結果顯示，在瓊脂培養(yǎng)條件下，與WT相比，轉基因系Line3和Line5在不同磷水平下的幼苗根數、根長、葉面積和根冠比均顯著增加。

圖4　過表達TaARF6轉基基煙草和野生型植株在正常生長及低磷處理下的植株形態(tài)特征Fig.4　The phenotypic features in plants of overexpressing TaARF6 and wild type under the conditions of normal growth and Pi deprivation

[注(Note):A-瓊脂培養(yǎng)Culturedbyagarmedium;B-溶液培養(yǎng)Culturedbyhydroponicsolution.A中，正常培養(yǎng)下幼苗培養(yǎng)時間為10d，低磷處理下幼苗培養(yǎng)時間為15dInA,theculturetimeswere10dand15dunderthenormalconditionandPi-deprivation,respectively.B中，正常培養(yǎng)下幼苗培養(yǎng)時間為3周，低磷處理下幼苗培養(yǎng)時間為4周InB,theculturetimeswerethreeweeksandfourweeksunderthenormalconditionandPi-deprivation,respectively.WT為野生型WTstandsforthewildtype;Line3和Line5為遺傳轉化TaARF6的煙草轉基因系Line3andLine5meanthetransgeniclinesintegratedTaARF6.]

同樣，在溶液培養(yǎng)條件下，轉基因系Line3和Line5的根體積、葉面積和根冠比在兩種磷水平下也均較對照(WT)顯著增加(表1)。上述結果與遺傳轉化TaARF6具有顯著提高不同磷水平下幼苗和植株根葉鮮、干重的結果相一致。

3　討論

生長素響應因子(ARF)是生長素信號早期應答成員，在介導植株對生長素的早期應答中發(fā)揮重要生物學功能。研究表明， 在響應生長素的三種重要順式調控元件TGA保守元件(AACGAC)、生長素響應保守盒AuxRR(GGTCCAT)和生長素響應元件AuxRE(TGTCTC)中，ARFs能與AuxRE特異性互作，啟動下游生長素響應基因表達[4-5, 17-18]。本研究對小麥TaARF6的研究表明，該基因編碼蛋白含有植物種屬中ARF家族成員通常含有的保守元件，如保守DNA互作區(qū)及生長素響應區(qū)。因此，TaARF6編碼蛋白在介導生長素信號轉導中可能行使著重要功能。

前人對植物種屬ARF家族基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，該家族中多數成員呈組成型表達特征，在多種組織和器官中均有表達[8, 19]。但該家族部分成員也呈典型的組織及器官特異性表達特征。如位于擬南芥第一對染色體上的ARF基因，呈胚性細胞和發(fā)育籽粒特異表達[8]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，部分ARF家族成員作為特定小分子RNA(microRNAs)作用靶基因，其表達在較大程度上受到與其作用microRNAs的轉錄后調控，其轉錄本因miRNAs表達水平改變而發(fā)生相應變化[20-21]。例如，對擬南芥miR160的作用靶基因研究發(fā)現(xiàn)，該小分子RNA作用靶基因中含有3個ARF家族成員，分別為ARF10、ARF16和ARF17[20]。上述ARF基因在轉錄后水平上受到miR160的調節(jié)后，進一步參與植株形態(tài)及生長素部分響應基因的調控[20]。本研究對TaARF6的表達研究發(fā)現(xiàn)，正常生長條件下，該基因在根葉中均有較高轉錄本豐度，低磷處理下，該基因表達水平下調; 將低磷逆境恢復正常供磷水平后，該基因表達水平再度回升。表明TaARF6的表達受到環(huán)境中磷(Pi)供應水平的調控。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TaARF6是小麥microRNA家族成員TaMIR167作用靶基因之一，而TaMIR167表達受到低磷逆境的誘導[21]。因此，TaARF6在表達水平上對環(huán)境中供磷水平的應答，可能是與其作用小分子RNA家族成員TaMIR167對低磷逆境上調應答后，進一步對該靶基因進行轉錄后的調控所致。因此，TaARF6可能與TaMIR167構成特定的小分子/靶基因作用模塊，參與植株對低磷逆境的響應過程。

ARFs成員廣泛參與植株生長發(fā)育的調節(jié)。研究表明，擬南芥AtARF3的突變體植株，下胚軸對生長素誘導的藍光響應變?yōu)檫t鈍，在生長特征上表現(xiàn)為對生長素響應不敏感的特點[10]，AtARF5與維管束和胚軸性建成有關[11]，AtARF2參與生長素誘導的幼苗下胚軸彎曲過程[12]，AtARF8則對生長素調控的幼苗下胚軸伸長和細胞內生長素的內穩(wěn)態(tài)產生重要影響[13]。對水稻ARF家族成員OsARF1的表達進行干涉后，植株生長變?yōu)榫徛?，活力變差，葉片呈卷曲性改變，育性降低[14]。本研究對遺傳轉化TaARF6的煙草植株研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長和低磷脅迫條件下，與野生型植株相比，轉基因植株的長勢和植株形態(tài)得到明顯改善，表現(xiàn)為根系數量、主側根長度、根體積、葉面積、根冠比以及根系、莖葉和單株鮮、干重顯著增加。因此，TaARF6具有增強不同供磷水平下植株生長的能力，這可能與增強TaARF6表達后，植株體內生長素響應基因表達水平上調、 進而促進植物組織細胞的分裂有關。本研究發(fā)現(xiàn)，TaARF6能顯著改善植株在低磷逆境下生長、根系形態(tài)建成及干物質累積，表明該基因在介導植株抵御低磷逆境中發(fā)揮著重要作用。因此，該基因在小麥抵御低磷能力鑒定和評價及創(chuàng)制新型耐低磷種質中可能具有重要實踐價值。有關TaARF6調控的下游基因及調節(jié)不同供磷水平下植株生長的分子機理有待進一步探討。

圖5　瓊脂培養(yǎng)下正常和低磷處理轉基因株系和野生型植株的鮮、 干重Fig.5　Fresh and dry weights of the TaARF6-overexpressing and wild type plants under the conditions of normal growth and Pi deprivation cultured by agar medium

[注(Note): 正常培養(yǎng)下幼苗培養(yǎng)時間為10d，低磷處理下幼苗培養(yǎng)時間為15dTheculturetimeswere10dand15dunderthenormalconditionandPi-deprivation,respectively. 正常培養(yǎng)和低磷處理結果的顯著性測定分析分別進行ThestatisticalsignificanceanalysisofdataobtainedunderthenormalgrowthconditionandthePi-deficientconditionwasseparatelyperformed. *表示同一供磷水平下與野生型對照的差異達到0.05顯著性水平Standsfortobesignificantdifferencewithcontrol(wildtype)atthe0.05statisticallevelunderthesamePi-supplycondition.]

圖6　溶液培養(yǎng)下正常生長和低磷處理TaARF6轉基因株系和野生型植株的鮮、 干重Fig.6　Fresh and dry weights of the TaARF6-overexpressing and wild type plants under the conditions of normal growth and Pi deprivation cultured by hydroponic solution

[注(Note): 正常培養(yǎng)下幼苗培養(yǎng)時間為3周，低磷處理下幼苗培養(yǎng)時間為4周TheculturetimeswerethreeweeksandfourweeksunderthenormalconditionandPi-deprivation,respectively. 正常培養(yǎng)和低磷處理結果的顯著性測定分析分別進行ThestatisticalsignificanceanalysisofdataobtainedunderthenormalgrowthconditionandthePi-deficientconditionwasseparatelyperformed. *表示同一供磷水平下與野生型對照的差異達到0.05顯著性水平Standsfortobesignificantdifferencewithcontrol(wildtype)atthe0.05statisticallevelunderthesamePi-supplycondition.]

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Regulationeffectsofanauxinresponsegeneinwheat(TaARF6)inmediatingplantgrowthunderconditionsofnormalgrowthandPideprivation

ZHIYi-ming,CHENFang,LIUXiao-man,XIAOKai*

(College of Agronomy, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001, China)

【Objectives】Auxinresponsefactors(ARFs)playacriticalroleinmediatingtransductionofauxinsignalingandregulatingexpressionofdownstreamauxin-responsivegenes.Inthisstudy,anARFtypetranscriptionfactorgenereferredtoTaARF6identifiedinarootsuppressionsubtractivecDNAlibrarythatenrichesthedifferentiallyexpressedgenesunderPisufficiencyasthebasiswasusedtoinvestigatemolecularcharacterizationofTaARF6anditsexpressionpatternsundervariousPi-supplyconditions,aswellasitsfunctionsinregulatingplantphenotypes.TheobjectiveofthisstudywasaimedtoelucidatebiologicalrolesofTaARF6inmediatingplantgrowthfeaturesundertheconditionsofPisufficiencyandPideficiency. 【Methods】TheproteincharacterizationofTaARF6waspredictedbythebioinformatics’tools.Theseedlingsofwheat(cv.Shixin828)wereculturedunderthesufficient-anddeficient-PiconditionsbyahydroponicapproachandusedtoinvestigatetheexpressionpatternsofTaARF6basedonsemi-quantitativeRT-PCR.ADNArecombinanttechniquewasadoptedtoconstructtheexpressioncassetteintegratingtheTaARF6openreadingframe.ThetransgenictobaccoplantsoverexpressingTaARF6weregeneratedbasedonagenetictransformationapproachmediatedbyAgobacterium-tumefaciensusingtheleafdiscsasexplants.Basedontheculturemethodsofagarmediumandhydroponicsolution,theseedlingsandplantsofthetransgenicLine3andLine5aswellaswildtype(WT)wereculturedtodeterminethegrowthfeaturesandtoassaythefreshanddryweightsofrootsandabovegroundtissuesundertheconditionsofPisufficiencyandPideficiency.【Results】 1) TaARF6encodesatranscriptionfactorcategoriedintoauxinresponsefactorfamilyandsharestheconserveddomainsofARFproteinsinplants,suchastheDNAbindingdomainandtheauxinresponsedomain.ItsharesahighidentitytoBdARF6andOsARF6,twoARFfamilymembersinB. distachyonandrice,respectively,attheaminoacidlevel.TheexpressionanalysisrevealsthatTaARF6issignificantlydown-regulatedbyPideprivationinrootsandleaves,anditsexpressionintheabovetissuesisrestoredbyarecoverytreatmentinitiatedbyretransferringthePi-deprivedplantstonormal-Picondition. 2)Comparedwiththewildtype,thetobaccoseedlingsandplantsoverexpressingTaARF6areimprovedunderbothPisufficiencyandPideficiencyconditions. 3)Comparedwiththewildtype,thefreshanddryweightsinroots,stemsandleaves,andinthewholeplantofthetobaccoseedlingsandplantswithoverexpressionofTaARF6areincreasedundertheconditionsofbothnormalgrowthandPideprivation,andthelateralrootnumbers,lengthsoftheprimaryandlateralroots,rootvolume,leafareasandtheratiosofrootweighttoabovegroundtissueweightarealsoincreased.【Conclusions】OurresultsinthisstudyconfirmthatTaARF6encodesatypicalauxinresponsefactor,anditsencodedproteincontainsdistinctdomainsgenerallysituatedinARFs. TaARF6issignificantlyresponsivetoexternalPilevels.OverexpressionofTaARF6canimproveplantgrowthfeatures,freshanddryweightsundertheconditionsofnormalgrowthandPideprivation.Together,ourinvestigationinthisstudysuggeststhatTaARF6playscriticalrolesinmediatingplantgrowthanddrymassproductionundervariousPi-supplyconditions,whichispossiblyfinishedthroughitstranscriptionalregulatingexpressionofthedownstreamauxin-responsivegenes.

wheat(Triticum aestivumL.);auxinresponsefactor(ARF);molecularcharacterization;

2014-11-13接受日期: 2015-01-15網絡出版日期: 2015-07-17

國家自然科學基金(31201674); 河北省自然科學基金(C2013204146)資助。

智一鳴(1988—)，女，河北高邑人，碩士研究生，主要從事作物營養(yǎng)生理和分子生物學研究。E-mail:zhiyiming2011@163.com

E-mail:xiaokai@hebau.edu.cn

S512.1.01;Q954.78

A

1008-505X(2016)01-0085-09