陳　麗，王　玥，郭美錦，儲(chǔ)　炬，莊英萍

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；2華東理工大學(xué)，上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

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研究簡報(bào)

多拷貝畢赤酵母表達(dá)豬胰島素前體的動(dòng)力學(xué)模型

陳麗1，2，王玥2，郭美錦2，儲(chǔ)炬2，莊英萍2

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；2華東理工大學(xué)，上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237）

以攜帶多拷貝豬胰島素前體（PIP）基因的畢赤酵母（Pichia pastoris）為供試菌株，對分批補(bǔ)料發(fā)酵PIP合成動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行研究。建立了不同拷貝數(shù)畢赤酵母發(fā)酵合成PIP的菌體生長、產(chǎn)物合成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型，并通過Origin8.0軟件對模型參數(shù)進(jìn)行了非線性擬合。根據(jù)動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著拷貝數(shù)的增加與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物系數(shù)α和細(xì)胞生長代謝系數(shù)k1絕對值不斷增加，12拷貝時(shí)PIP表達(dá)量達(dá)到最高，說明只有進(jìn)一步促進(jìn)高拷貝菌株細(xì)胞生長并減少其代謝負(fù)擔(dān)才能更有效地提高產(chǎn)物的生成速率。 同時(shí)表明：預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值有良好的擬合性，所建模型能較好地反映分批補(bǔ)料發(fā)酵過程PIP的合成。

重組畢赤酵母；豬胰島素前體表達(dá)；拷貝數(shù)；動(dòng)力學(xué)模型

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151432

引　言

胰島素（insulin）是體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝和糖代謝的重要激素，是治療I型糖尿病的特效藥物之一。大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）都曾用于胰島素的工業(yè)化生產(chǎn)［1-2］。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種優(yōu)秀的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因啟動(dòng)子（PAOX1）、外源蛋白表達(dá)量高、易于分離、外源基因穩(wěn)定性高、培養(yǎng)基要求低和日臻成熟的高密度發(fā)酵工藝等特點(diǎn)［3-5］。畢赤酵母表達(dá)出的豬胰島素前體（porcine insulin precursor，PIP）經(jīng)純化及體外轉(zhuǎn)肽可成為醫(yī)用人胰島素，該方法可為臨床提供大量質(zhì)量可靠及價(jià)格低廉的重組人胰島素［6］。

基因劑量（gene dosage）是外源目的蛋白在重組畢赤酵母表達(dá)水平高低的重要影響因素之一。根據(jù)不同的外源蛋白特性，基因劑量對外源蛋白表達(dá)水平既有正的量效關(guān)系，也有負(fù)的量效關(guān)系，但是各自影響機(jī)理不盡相同［7-8］。目前用畢赤酵母表達(dá)PIP的報(bào)道較多停留在菌株的構(gòu)建和過程控制優(yōu)化等方面［9-11］，雖有文獻(xiàn)報(bào)道畢赤酵母體系的動(dòng)力學(xué)模型及其參數(shù)的估算［12-14］，但是對多拷貝數(shù)畢赤酵母動(dòng)力學(xué)模型的研究較少。

因此，本文將以PIP基因拷貝數(shù)分別為1、6、12和18的畢赤酵母重組菌為研究對象，通過5L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，建立不同拷貝數(shù)畢赤酵母菌體生長、產(chǎn)物生成和底物（甲醇）消耗動(dòng)力學(xué)模型，確定模型參數(shù)，并對模型進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1菌株、培養(yǎng)基和種子制備

畢赤酵母GS115菌株，Mut+，載體pAO815、pPIC3.5K，蛋白引導(dǎo)序列來自釀酒酵母的α-雜交因子（α-mating factor， α-MF），外源基因?yàn)楦鶕?jù)畢赤酵母偏愛密碼子人工合成的PIP基因，分別含目的基因1、6、12和18拷貝的菌株，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［15］。培養(yǎng)基和種子制備方法按文獻(xiàn)［16］。

1.25L發(fā)酵罐發(fā)酵方法

從YPD平板上挑單克隆接種至種子搖瓶培養(yǎng)基中， 30℃，220 r·min-1，培養(yǎng)20～24 h，直至OD600達(dá)到20左右，按接種量10%接種到裝有2 L分批培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐（上海國強(qiáng)生化工程公司，型號(hào)：FUS-5L）中進(jìn)行培養(yǎng)（用氨水調(diào)節(jié)pH為5.0）。分批培養(yǎng)至甘油耗盡（20 h左右），此時(shí)溶解氧（dissolved oxygen，DO）與pH上升。然后以限制性流速補(bǔ)甘油（500 g·L-1，含12 ml·L-1PTM1）進(jìn)而提高菌濃。當(dāng)OD600達(dá)到120左右，停止補(bǔ)甘油，饑餓工程菌30 min，一次性加入分析純甲醇使甲醇濃度達(dá)到2.5 g·L-1，以使細(xì)胞適應(yīng)甲醇環(huán)境，2 h左右DO先下降后上升，再正式進(jìn)入誘導(dǎo)PIP表達(dá)發(fā)酵階段，流加100%的甲醇（含12 ml·L-1PTM1），誘導(dǎo)72 h，在誘導(dǎo)過程中通過測定甲醇濃度和DO變化來控制甲醇流加速率。

1.3細(xì)胞光密度OD600測定

取樣發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后于波長600 nm處，以去離子水為對照進(jìn)行比色測定，OD600=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.4目的蛋白PIP濃度的測定

采用外標(biāo)法進(jìn)行PIP的定量分析。使用Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為ES industries 公司MacroSep C8，5 μm 300?（15 cm×4.60 mm）；流動(dòng)相：溶液A為20%乙腈，0.1%三氟乙酸；溶液B為90%乙腈，0.1%三氟乙酸；洗脫條件：溶液A 在14 min 內(nèi)由100%降至70%，溶液B在14 min 內(nèi)由0增大至30%；流速：1 ml·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：214 nm。

1.5甲醇濃度分析

采用GC920氣相色譜儀（上海海欣色譜儀器有限公司）分析發(fā)酵液上清中甲醇濃度。填料為Chromosorb101型，色譜柱長1 m，內(nèi)徑2 mm，載氣為氮?dú)?，流量?5 ml·min-1，空氣和H2的流量分別為300 ml·min-1和30 ml·min-1（10：1），色譜柱溫度為100℃，汽化室和氫火焰溫度為200℃。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.1.1細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型的建立根據(jù)微生物細(xì)胞生長特點(diǎn)，細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)最常用Monod和Logistic方程描述。

雖然Monod方程模型簡單且有效地描述了菌體的生長，但是其僅僅適應(yīng)于不存在其他限制性物質(zhì)的情況下使用，由于本文采用畢赤酵母補(bǔ)料分批培養(yǎng)的過程，達(dá)到細(xì)胞高密度后發(fā)酵液黏稠，為此采用Logistic方程模型來描述菌體生長規(guī)律［17］。

Logistic模型是一個(gè)典型的S形曲線，能較好反映發(fā)酵過程中菌體濃度增加對自身生長帶來的抑制作用。發(fā)酵開始時(shí)，菌體濃度很低，即X比Xm小得多，X/Xm項(xiàng)可以忽略不計(jì)，式（1）表示細(xì)胞生長呈對數(shù)生長；對數(shù)生長期結(jié)束后菌體生長處于穩(wěn)定期，此時(shí)X接近于Xm，式（1）表示菌體生長停止。

Logistic方程

2.1.2表達(dá)產(chǎn)物PIP生成動(dòng)力學(xué)模型的建立微生物發(fā)酵生成的代謝產(chǎn)物非常復(fù)雜，涉及到的范圍也比較廣，包括醇類、有機(jī)酸、核酸類、抗生素、維生素、氨基酸、酶、生理活性物質(zhì)等，并且由于細(xì)胞內(nèi)生物合成的途徑十分復(fù)雜，其生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制也各具有不同的特點(diǎn)，因此，至今為止還沒有統(tǒng)一的模型可用來描述產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)。

Gaden［18］根據(jù)細(xì)胞生長速率與產(chǎn)物生成速率之間的關(guān)系，其通用模型可用Leudeking-Piret方程［19］表示

式中，α為與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)g·g-1，β為不與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)，g·g-1·h-1。當(dāng)α≠0，β=0時(shí)為生長偶聯(lián)型；α=0，β≠0時(shí)為非生長偶聯(lián)型；α≠0，β≠0時(shí)為部分生長偶聯(lián)型。對于畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)豬胰島素前體（PIP），可以主要分為兩個(gè)階段，第1階段為細(xì)胞生長階段，這時(shí)無產(chǎn)物生成，在此不考慮其模型；第2階段為PIP蛋白表達(dá)階段，細(xì)胞生長的同時(shí)產(chǎn)物也合成，最終細(xì)胞生長量趨于穩(wěn)定，但PIP蛋白繼續(xù)合成。根據(jù)Jose等［20］報(bào)道，畢赤酵母發(fā)酵屬于部分生長偶聯(lián)型，即α≠0，β≠0。

將式（1）代入式（3）簡化得

積分得

2.1.3底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立在畢赤酵母發(fā)酵過程中，甲醇消耗主要有3個(gè)方面生理作用：一是細(xì)胞生長的消耗，用以合成新的細(xì)胞；二是細(xì)胞維持生命活動(dòng)的消耗；三是生成代謝產(chǎn)物的消耗。甲醇的累計(jì)消耗動(dòng)力學(xué)模型可采用以下方程

式中，S為甲醇從開始補(bǔ)料后的累計(jì)補(bǔ)料量，g·L-1；YX/S為甲醇用于菌體生長的得率系數(shù)，g·g-1；YP/S為甲醇用于產(chǎn)物合成的得率系數(shù)，g·g-1；m為維持常數(shù)，g·g-1·h-1。

為簡化模型，細(xì)胞呼吸等維持代謝消耗的甲醇，可以歸結(jié)在細(xì)胞生長消耗之內(nèi)。畢赤酵母發(fā)酵的基質(zhì)消耗大致可分為生長消耗和生成PIP產(chǎn)物消耗兩部分?；|(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型簡化為

式中，k1為細(xì)胞生長代謝系數(shù)，k2為產(chǎn)物形成代謝系數(shù)。

將式（1）、式（4）代入式（7）得

積分得

式（1）、式（3）和式（7）構(gòu)成畢赤酵母表達(dá)PIP發(fā)酵過程中細(xì)胞生長、PIP表達(dá)以及甲醇補(bǔ)料消耗的動(dòng)力學(xué)模型；式（2）、式（5）和式（9）分別為3個(gè)模型的積分形式，有助于模型的擬合求解。該模型共6個(gè)參數(shù)mμ、Xm、α、β、k1、k2描述了發(fā)酵過程中細(xì)胞生長、PIP表達(dá)及甲醇代謝量同發(fā)酵時(shí)間之間的函數(shù)關(guān)系。

2.2模型參數(shù)求解

根據(jù)不同拷貝數(shù)的補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用OriginPro8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合規(guī)劃，采用全局性收斂的修正高斯牛頓法（Levenberg-Marquardt-LM），進(jìn)而獲得模型參數(shù)的最優(yōu)估計(jì)值，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出不同拷貝數(shù)最大比生長速率mμ差異不顯著，且均比整個(gè)誘導(dǎo)階段平均比生長速率μ高，這主要是因?yàn)檎T導(dǎo)前期拷貝數(shù)對畢赤酵母細(xì)胞的生長影響不大，都能達(dá)到較快速度生長，達(dá)到相似的最大比生長速率mμ。模型中與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù)α均大于與菌體量相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù)β，并且隨著拷貝數(shù)的增加與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物系數(shù)α不斷增加，因此，畢赤酵母補(bǔ)料分批發(fā)酵中產(chǎn)物生成與菌體生長呈部分偶聯(lián)關(guān)系，并且與菌體生長偶聯(lián)程度較高，高拷貝菌株表達(dá)量高于1拷貝菌株其中一個(gè)主要原因就是α較高，只有進(jìn)一步促進(jìn)高拷貝菌株細(xì)胞生長才能更有效地提高PIP的生成速率。從細(xì)胞生長代謝系數(shù)k1也可以看出，隨著拷貝數(shù)的增加k1絕對值不斷增加，這更驗(yàn)證了高拷貝菌株對生長代謝的要求比較高。

表1　R補(bǔ)料分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)值Table 1　Kinetic parameters estimated for multi-copy P. pastoris cells

圖1　菌體生長的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值之間的比較Fig.1　Comparison of experimental data with predicted values of cell growth

非線性規(guī)劃得到不同拷貝數(shù)菌株的4個(gè)動(dòng)力學(xué)模型分別為

1-copy：

6-copy：

12-copy：

圖2　PIP生成的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值之間的比較Fig.2　Comparison of experimental data with predicted values of PIP formation

圖3　累計(jì)甲醇消耗的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值之間的比較Fig.3　Comparison of experimental data with predicted values of total methanol consumption amount

18-copy：

2.3模型的驗(yàn)證及分析

應(yīng)用以上求解出來的不同拷貝數(shù)動(dòng)力學(xué)模型繪制模型的曲線圖，并將其與甲醇補(bǔ)料發(fā)酵的重復(fù)實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1～圖3所示。圖中的曲線分別為不同拷貝數(shù)菌體生長、產(chǎn)物生產(chǎn)和底物累計(jì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線。

由圖1～圖3可以看出，不同拷貝數(shù)菌株擬合值與實(shí)驗(yàn)值非常接近，大部分?jǐn)M合情況較好，平均相對偏差均在5%以內(nèi)，說明所建數(shù)學(xué)模型較好地反映了多拷貝數(shù)畢赤酵母菌株P(guān)IP分批補(bǔ)料發(fā)酵過程。由于沒有考慮在甲醇補(bǔ)料發(fā)酵過程中補(bǔ)料液的流加對發(fā)酵液總體積的影響，因此本研究建立的數(shù)學(xué)模型僅適用于那些發(fā)酵液體積變化不大的補(bǔ)料發(fā)酵過程。

3　結(jié)　論

通過對多拷貝畢赤酵母生產(chǎn)PIP分批補(bǔ)料發(fā)酵的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，采用Origin8.0軟件分析得出了不同外源基因拷貝數(shù)菌體細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成與底物消耗3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)甲醇補(bǔ)料發(fā)酵的特點(diǎn)，建立了發(fā)酵過程的菌體生長、產(chǎn)物生成和甲醇累計(jì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著拷貝數(shù)的增加與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物系數(shù)α和細(xì)胞生長代謝系數(shù)k1絕對值不斷增加，12拷貝時(shí)PIP表達(dá)量達(dá)到最高，說明只有進(jìn)一步促進(jìn)高拷貝菌株細(xì)胞生長并減少其代謝負(fù)擔(dān)才能更有效地提高產(chǎn)物的生成速率。將發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)值與模型曲線進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者基本吻合，表明所建立模型能較好地反映PIP分批補(bǔ)料發(fā)酵過程。由于沒有考慮在甲醇補(bǔ)料發(fā)酵過程中補(bǔ)料液的流加對發(fā)酵液總體積的影響，因此本研究建立的數(shù)學(xué)模型僅適用于那些發(fā)酵液體積變化不大的補(bǔ)料發(fā)酵過程。

符號(hào)說明

k1——細(xì)胞生長代謝系數(shù)

k2——產(chǎn)物形成代謝系數(shù)

m——維持常數(shù)，g·g-1·h-1

P——目標(biāo)產(chǎn)物濃度，g·L-1

S——基質(zhì)濃度，g·L-1

X，X0，Xm——分別為實(shí)際、初始、最大菌體濃度，

g·L-1

YP/S——甲醇用于產(chǎn)物合成的得率系數(shù)，g·g-1

YX/S——甲醇用于菌體生長的得率系數(shù)，g·g-1

α——與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)，

g·g-1

β——不與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常

數(shù)，g·g-1·h-1

μm——最大比生長速率，h-1

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Kinetic modelling of porcine insulin precursor （PIP） expressed by multi-copy recombinant Pichia pastoris

CHEN Li1，2， WANG Yue2， GUO Meijin2， CHU Ju2， ZHUANG Yingping2
（1National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014， Jiangsu， China；2Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China）

Kinetic modelling of recombinant Pichia pastoris harboring multiple porcine insulin precursor （PIP）gene dosages was studied when the cells were grown in the fed-batch culture. The key parameters of this kinetics were estimated， including specific cell growth rate （h-1）， PIP production rate （g·g-1·h-1） and substrate consumption rate （g·g-1·h-1） with nonlinear curve fit by Origin8.0. The results showed that both growth-associated production coefficient （α） and growth-associated metabolism coefficient （k1） increased with increasing copy numbers. The expression level of PIP reached the highest at the copy number of 12. These results suggested that rapid growth and lower metabolic burden of a high copy number effectively improved the production rate of target proteins. Furthermore， the predicted values based on the established kinetic model were in good agreement with the experimental data， indicating that the kinetic model could be used to describe recombinant PIP production process in fed-batch fermentation mode.

date： 2015-09-10.

Prof. GUO Meijin， guo_mj@ecust.edu.cn

supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest（201303046）， the National High Technology Research and Development Program of China （2012AA021201）， and the Open Project Program of State Key Laboratory of Bioreactor Engineering（2060204）.

recombinant Pichia pastoris； porcine insulin precursor expression； gene dosage； kinetic model

TQ 464.7

A

0438—1157（2016）05—2015—07

2015-09-10收到初稿，2015-11-19收到修改稿。

聯(lián)系人：郭美錦。第一作者：陳麗（1979—），女，碩士，助理研究員。

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201303046）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2012AA021201）；生物反應(yīng)器工程國重室開放課題資助（2060204）。