廖　妮

(攀枝花學(xué)院　生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川　攀枝花　617000)

?

基于自增強(qiáng)Ru(Ⅱ)復(fù)合物構(gòu)建的新型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測甲胎蛋白

廖妮*

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000)

自增強(qiáng)；免疫傳感器；甲胎蛋白；金納米籠；空心納米金

甲胎蛋白(AFP)是存在于正常胎兒血清中的一種胎兒特異性蛋白質(zhì)，新生兒期迅速減少。1964年，Tatarinow研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者的血清中存在AFP，之后大量臨床研究證實(shí)AFP對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌有高度的特異性，因此，AFP常作為診斷和檢測原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異性臨床指標(biāo)。AFP是一種分子量為6.9萬的含糖量3%的糖蛋白，在正常成人血清中的平均含量為3.4 ng/mL，但在某些腫瘤尤其是原發(fā)性肝癌患者的血清中AFP含量升高，如果成人血清中的AFP含量高于20 ng/mL，則意味著可能患有肝癌[1-6]。因次，血清中的AFP含量可作為臨床診斷某些腫瘤的指標(biāo)，其研究及檢測具有重要意義。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司、中科院長春應(yīng)化所)，在檢測過程中光電倍增高壓為800 V，掃速為100 mV/s；采用三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。循環(huán)伏安測試采用CHI610A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。不同納米復(fù)合物的形貌采用S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi Instrument公司)表征，加速電壓為20 kV。BRANSONIC 200超聲清洗儀(德國Branson Ultraschall公司)。

1.2自增強(qiáng)釕化合物Ru(Ⅱ)@L-Arg的合成

圖1　Ru(Ⅱ)@L-Arg化合物的合成示意圖Fig.1　A schematic diagram of the procedure used to prepare Ru(Ⅱ)@L-Arg compounds

1.3金納米籠(AuNCs)的制備

金納米籠(AuNCs)是以納米銀立方為模板，利用置換反應(yīng)制得。合成步驟參考文獻(xiàn)[32]進(jìn)行簡單的修改。①納米銀立方體(AgNCs)的合成：取30 mL乙二醇(EG)置于三頸燒瓶中，在磁力攪拌下加熱至160 ℃，然后加入10 mL含0.2 g聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液，隨后加入400 μL 3 mmol/L硫化鈉的乙二醇溶液。最后將3 mL硝酸銀的乙二醇溶液(282 mmol/L)緩慢滴加到上述溶液中，在該過程中保持溶液溫度為160 ℃，觀察到溶液的顏色由白色變?yōu)楹稚珪r(shí)，停止加熱，室溫冷卻，用丙酮離心洗滌，將收集的納米銀立方再溶于30 mL水中。②金納米籠的制備：將制備好的30 mL納米銀立方水溶液加熱至沸，保持沸騰10 min，然后緩慢加入100 μL氯金酸(10 mg/mL)，并持續(xù)沸騰，觀察到溶液的顏色從棕色變?yōu)榉奂t色，并保持不變后停止加熱，冷卻，得到金納米籠。將得到的膠體金納米籠離心洗滌，分散在PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，備用。

1.4空心納米金顆粒(HGNPs)的制備

于100 mL水中加入400 μL 0.1 mol/L的檸檬酸鈉和400 μL新制備的1.0 mol/L硼氫化鈉，室溫下通氮?dú)鈹嚢?，然后加?00 μL 0.5 mol/L氯化鈷溶液，繼續(xù)通氮?dú)鈹嚢?，溶液由粉紅色變成棕灰色，說明鈷離子被還原成鈷納米粒子，然后繼續(xù)攪拌10 min，使鈷離子反應(yīng)完全。加大氮?dú)馔ㄈ肓?，?00 μL 0.1 mol/L的氯金酸溶液緩慢滴加到混合溶液中，滴加完成后停止通氮?dú)?，繼續(xù)室溫下攪拌，使鈷納米粒子在空氣中再氧化成鈷離子，溶液由棕灰色變成藍(lán)紫色，攪拌30 min后，將該溶液離心洗滌，然后分散到1 mL PBS(pH 7.4)緩沖溶液中得到空心納米金顆粒。

1.5巰基化碳納米管(SH-CNTs)的制備

CNTs的巰基化是通過化學(xué)手段使其表面帶巰基，具體制備過程如下：首先，為使CNTs得到更多活化的羧基基團(tuán)，取2.0 mg CNTs和0.5 mg PTCA溶于5.0 mL水中，在室溫條件下攪拌12 h，通過π-π堆積作用使PTCA修飾到CNTs上[33]。向上述溶液中加入2.5 mL EDC和NHS(4∶1)混合溶液攪拌一夜，充分活化CNTs表面的羧基后，加入L-半胱氨酸(L-Cys)持續(xù)攪拌8 h，即生成表面帶巰基的CNTs(SH-CNTs)。將得到的SH-CNTs離心洗滌，分散在水中，備用。

1.6二抗復(fù)合物(Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg@BSA)的制備

取1 mL自增強(qiáng)Ru(Ⅱ)@L-Arg溶液，向上述溶液中加入2 mL金納米籠(AuNCs)溶液，然后加入0.2 mL anti-AFP(Ab2)，并使其在4 ℃下反應(yīng)6 h。4 ℃下以10 000 r/min離心30 min除去多余的Ab2，得到產(chǎn)物Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg。然后將其分散于1 mL PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，向其中加入0.5 mL BSA(25 mg/mL)溶液，并于4 ℃下反應(yīng)4 h以封閉AgNCs表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。最后，通過離心得到產(chǎn)物Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg@BSA，并分散于1 mL PBS(pH 7.4)中，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.7免疫傳感器的制備

電極在修飾之前，先用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉在拋光布上打磨光滑，然后分別用水和乙醇依次超聲清洗，除去表面雜質(zhì)，最后用水清洗干凈，表面光滑的電極在空氣中放置，干燥備用。

電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的示意圖如圖2所示：取1 mL SH-CNTs加至2 mL 0.5%的Nafion乙醇溶液并超聲處理，得到均勻的Nf-SH-CNTs懸濁液。取3 μL Nf-SH-CNTs滴加到預(yù)處理過的玻碳電極表面，在室溫下空氣中干燥，得到一層致密的Nf-SH-CNTs膜。將Nf-SH-CNTs修飾電極浸泡在10 μL空心納米金顆粒溶液中，在濕潤的條件下孵育5 h，通過Au-S鍵作用將空心納米金顆粒修飾到電極表面得到HGNPs/Nf-SH-CNTs修飾電極。取15 μL AFP抗體溶液(簡稱Ab1)在4 ℃下孵育12 h。用水沖去物理吸附的Ab1，然后孵育15 μL 1%牛血清白蛋白(BSA)1 h，用水洗滌后，將得到的免疫傳感器儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖2　電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝過程示意圖Fig.2　Schematic diagrams of the immunosensor A:the preparation procedure of Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg(Ab2 bioconjugates)

1.8電極的測試過程

根據(jù)雙抗夾心模式，在測試之前，將免疫傳感器在常溫條件下浸于不同濃度的AFP溶液中孵育30 min。將該修飾有目標(biāo)抗原的傳感器與Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg二抗復(fù)合物探針孵育40 min，通過免疫反應(yīng)結(jié)合到電極表面。然后采用MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對(duì)所修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究，測試底液為3 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液。

2　結(jié)果與討論

2.1不同納米材料的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)HGNPs和AuNCs兩種納米材料進(jìn)行表征(圖3)。由圖可見HGNPs是形狀規(guī)則的球形(圖3A)，球形的中間顏色較暗，說明其為空心結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道[34]一致。而AuNCs的形貌呈方形結(jié)構(gòu)(圖3B)，與文獻(xiàn)[32,35]所描述的基本相似，說明AuNCs已成功制備。

2.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化及機(jī)理探究

(1)

(2)

(3)

(4)

由于該傳感器用于抗原的檢測，考慮到蛋白質(zhì)分子的活性問題，因此選擇對(duì)Ru(Ⅱ)@L-Arg的ECL發(fā)光性能影響較小且接近人體液體環(huán)境的pH值，即pH 7.4的PBS緩沖溶液作為檢測底液。

圖3　HGNPs(A)和AuNCs(B)的掃描電鏡表征圖Fig.3　SEM images of HGNPs(A) and AuNCs(B)

圖4　裸玻碳電極在Ru(Ⅱ)@L-Arg,Ru(Ⅱ),Ru(Ⅱ)+ L-Arg中的ECL響應(yīng)對(duì)比Fig.4　ECL responses of the bare GCE in PBS(pH=7.4)(a), containing Ru(Ⅱ)(b),containing Ru(Ⅱ) and L-Arg(c), containing Ru(Ⅱ)@L-Arg(d)

進(jìn)一步考察了體系中自增強(qiáng)Ru(Ⅱ)@L-Arg,Ru(Ⅱ)和Ru(Ⅱ)+L-Arg的ECL響應(yīng)情況(如圖4)，在掃描電壓0.2～1.25 V范圍內(nèi)，分別將裸玻碳電極在Ru(Ⅱ)、Ru(Ⅱ)@L-Arg的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中進(jìn)行掃描，并在Ru(Ⅱ)的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中加入L-Arg對(duì)裸玻碳電極進(jìn)行掃描。結(jié)果表明,在PBS中加入L-Arg后Ru(Ⅱ)的ECL強(qiáng)度(曲線c)明顯高于未加L-Arg(曲線b)時(shí)的強(qiáng)度，但低于Ru(Ⅱ)@L-Arg(曲線d)的ECL強(qiáng)度。而裸玻碳電極在PBS(pH 7.4)緩沖溶液底液中進(jìn)行掃描時(shí)無ECL信號(hào)(曲線a)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ru(Ⅱ)@L-Arg自增強(qiáng)化合物可得到更強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度。這表明分子內(nèi)ECL反應(yīng)因縮短了電子傳輸路徑，減少了能量損失，可以得到比分子間ECL反應(yīng)更強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度。

圖5　電極不同修飾階段的循環(huán)伏安圖Fig.5　Cyclic voltammograms(CVs) of different modified electrodes a.GCE,b.Nf-SH-CNTs/GCE,c.HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE, d.anti-AFP/HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE,e.BSA/anti-AFP/ HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE,f.AFP/BSA/anti-AFP/HGNPs/ Nf-SH-CNTs/GCE,g.Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg/AFP/ BSA/anti-AFP/HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE；insert:EIS plots of different modified electrodes；buffer:0.1 mol/L PBS0.1 mol/L KCl

2.3電極修飾過程的循環(huán)伏安及電化學(xué)交流阻抗性能表征

采用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)(EIS)對(duì)電極的每一步修飾進(jìn)行表征(圖5插圖)。由裸玻碳電極的阻抗圖(曲線a)可以看到本體阻抗較小，說明裸玻碳電極具有很好的導(dǎo)電性能。當(dāng)巰基化的碳納米管修飾到玻碳電極上后(曲線b)，半圓直徑減小，說明電極阻抗值減小，表明巰基化的碳納米管能促進(jìn)電子傳輸。引入HGNPs后，由于HGNPs具有良好的電子傳輸能力且增大了電極的比表面積，所以半圓直徑顯著減少，說明電極阻抗值繼續(xù)降低(曲線c)。Anti-AFP蛋白分子固載到電極表面后，電極阻抗值明顯增大(曲線d)，這是由于形成了蛋白質(zhì)分子層，不利于電子的傳輸。用BSA封閉多余結(jié)合位點(diǎn)(曲線e)，進(jìn)一步孵育上抗原(曲線f)，然后孵育二抗偶合物(曲線g)。電極阻抗值持續(xù)增大，這是由于蛋白質(zhì)層阻礙了電極表面電子的傳輸。

2.4免疫傳感器的性能

2.4.1免疫傳感器對(duì)AFP的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)特性在優(yōu)化條件下，通過夾心免疫反應(yīng)策略測定了不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的AFP抗原對(duì)應(yīng)的ECL響應(yīng)。結(jié)果顯示ECL響應(yīng)信號(hào)隨抗原濃度的增加而不斷增加，在1.0×10-5～1.0×10-3ng/mL范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度(I)與AFP抗原濃度(c，ng/mL)的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系,線性方程為I=2 252 lgc+11 662，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.993;檢出限(S/N=3)為3.3×10-6ng/mL。將該方法與已報(bào)道的其他檢測AFP的方法進(jìn)行比較(見表1)，結(jié)果可見本方法對(duì)于AFP的檢測具有較好檢出限和較寬的檢測范圍。

表1　該實(shí)驗(yàn)方法與其他檢測AFP方法的對(duì)比

2.4.2免疫傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及選擇性考察了該ECL免疫傳感器的穩(wěn)定性，將目標(biāo)傳感器在測試底液中連續(xù)掃描10圈，其ECL的響應(yīng)變化很小，說明該傳感器的穩(wěn)定性很好。取10支制備的ECL免疫傳感器，分別對(duì)1 pg/mL的AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，測得10支傳感器結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%，表明該免疫傳感器具有良好的精確性和重現(xiàn)性。

選擇高濃度的癌胚抗原(CEA)、免疫球蛋白G(IgG)和牛血清白蛋白(BSA)作為干擾物質(zhì)，考察了該免疫傳感器的選擇性。結(jié)果顯示，當(dāng)無目標(biāo)抗原時(shí)，傳感器對(duì)3種干擾物混合溶液的ECL響應(yīng)與空白時(shí)的ECL響應(yīng)無明顯差異，說明該傳感器的非特異性吸附很小，而將干擾蛋白摻入目標(biāo)蛋白得到的ECL信號(hào)與只有目標(biāo)抗原時(shí)獲得的ECL響應(yīng)信號(hào)差異也很小(RSD為2.5%)，說明在有其他干擾蛋白存在時(shí)制得的免疫傳感器對(duì)AFP的檢測特異選擇性也比較理想。

2.4.3免疫傳感器的回收率測定為進(jìn)一步研究該免疫傳感器的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，配制含不同濃度AFP(0.05,0.10,0.50,1.00 ng/mL)的血清樣品，用制備的傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該免疫傳感器的回收率分別為106.0%，98.0%，106.0%，102.0%，可較好地應(yīng)用于人血清樣品中AFP的直接檢測。

3　結(jié)　論

本文利用共反應(yīng)試劑和發(fā)光體形成一個(gè)分子，合成了一種新型的ECL發(fā)光體Ru(Ⅱ)復(fù)合物?；谠揜u(Ⅱ)的復(fù)合物，以金納米籠作為固載基質(zhì)構(gòu)建了一個(gè)信號(hào)增強(qiáng)型的免疫傳感器用于AFP抗原檢測,此ECL系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光效率和穩(wěn)定性，且無需添加共反應(yīng)試劑。該ECL免疫傳感器為超低濃度蛋白質(zhì)的檢測提供了一種方法參考，并為生物分子檢測和生物分析提供了新的可能性。

[1]Ju H X,Yan G F,Chen F,Chen H Y.Electroanalysis,1999,11(2):124-128.

[2]Nomura F,Ohnishi K,Tanabe Y.Cancer,1989,64(8):1700-1707.

[3]Wang H J,Niu H,Cao Y L,Liu H J.Biosens.Bioelectron.,2012,37:6-10.

[4]Niu H,Yuan R,Chai Y Q,Mao L,Yuan Y L,Zhuo Y,Yuan S R,Yang X.Biosens.Bioelectron.,2011,26:3175-3180.

[5]Yang Z J,Fu Z F,Yan F,Liu H,Ju H X.Biosens.Bioelectron.,2008,24(1):35-40.

[6]Zhang Q Y,Wang X,Li Z J,Lin J M.Anal.Chim.Acta,2009,631(2):212-217.

[7]Liew M,Groll M C,Thompson J E,Call S L,Moser J E,Hoopes J D,Voelkerdingl K,Wittwer C.Biotechniques,2007,42:327-333.

[8]Cai Y Y,Li H,Du B,Yang M H,Li Y,Wu D,Zhao Y F,Dai Y X,Wei Q.Biomaterials,2011,32(8):2117-2123.[9]Teramura Y,Iwata H.Anal.Biochem.,2007,365(2):201-207.

[10]Wang G L,Yuan J L,Gong B L,Matsumoto K,Hu Z D.Anal.Chim.Acta,2001,448(1):165-172.

[11]Zhu J,Li J J,Wang A Q,Chen Y，Zhao J W.NanoscaleRes.Lett.,2010,5:1496-1501.

[12]Wang H Y,Sun D Y,Tan Z A,Gong W,Wang L.ColloidsSurf.B,2011,84(2):515-519.

[13]Bertoncello P,Forster R J.Biosens.Bioelectron.,2009,24(11):3191-3200.

[14]Swanick K N,Ladouceur S,Zysman-Colman E,Ding Z F.Chem.Commun.,2012,48:3179-3181.

[15]Chen Z H,Liu Y,Wang Y Z,Zhao X,Li J H.Anal.Chem.,2013,85(9):4431-4438.

[16]Ding C F,Wei S,Liu H T.Chem.-Eur.J.,2012,18:7263-7268.

[17]Deng S Y,Ju H X.Analyst,2013,138:43-61.

[18]Nie G M,Bai Z M,Yu W Y,Chen J.Biomacromolecules,2013,14(3):834-840.

[19]Kim Y,Kim J.Anal.Chem.，2014,86(3):1654-1660.

[20]Kumar S S,Bard A J.Anal.Chem.,2013,85(1):292-298.

[21]Wei H,Liu J F,Zhou L L,Li J,Jiang X,Kang J Z,Yang X R,Dong S J,Wang E K.Chem.Eur.J.,2008,14:3687-3693.

[22]White H S,Bard A J.J.Am.Chem.Soc.,1982,104(25):6891-6895.

[23]Liu X Q,Shi L H,Niu W X,Li H J,Xu G B.Angew.Chem.Int.Ed.,2007,119:425-428.

[24]Liu X Q,Niu W X,Li H J,Han S,Hu L Z,Xu G B.Electrochem.Commun.,2008,10:1250-1253.

[25]Yue X X,Zhu Z Y,Zhang M N,Ye Z Q.Anal.Chem.,2015,87:1839-1845.

[26]Li J G,Yan Q Y,Gao Y L,Ju H X.Anal.Chem.,2006,78:2694-2699.

[27]Lei R,Wang X Y,Zhu S F,Li N.Sens.ActuatorsB,2011,158:124-129.

[28]Sun J,Liang P,Martin M T,Dong L.US,2005,Patent 20050181443.

[29]Sun S G,Yang Y,Liu F Y,Fan J L,Peng X J,Kehr J,Sun L C，Peng X J.DaltonTrans.,2010,39:8626-8630.[30]Zhuo Y,Liao N,Chai Y Q,Gui G F,Zhao M,Han J,Xiang Y,Yuan R.Anal.Chem.,2014,86(2):1053-1060.[31]Au L,Chen Y,Zhou F,Camargo P H,Lim B,Li Z Y N,Ginger D S,Xia Y N.NanoRes.,2008,6(1):441-449.

[32]Skrabalak S E,Chen J,Sun Y G,Lu X M,Au L,Cobley C M,Xia Y N.Acc.Chem.Res.,2008,41(12):1587-1595.

[33]Wu B H,Hu D,Kuang Y J,Yu Y M,Zhang X H,Chen J H.Chem.Commun.,2011,47:5253-5256.

[34]Gui G F,Zhuo Y,Chai Y Q.Biosens.Bioelectron.，2013,47:524-529.

[35]Gui G F,Zhuo Y,Chai Y Q，Yuan R.Anal.Chem.,2014,86(12):5873-5880.

[36]Lin Z Y,Chen J H,Chen G N.Luminescence,2008,23(6):365-369.

[37]Xu R,Jiang Y D,Xia L,Zhang T X,Xu L,Zhang S,Liu D L,Song H W.Biosens.Bioelectron.,2015,74:411-417.[38]Wang Z F,Liu N,Feng F,Ma Z F.Biosens.Bioelectron.,2015,70:98-105.

[39]Zhang L N,Li L,Ma C,Ge S G,Yan M,Bian C R.Sens.ActuatorsB，2015,221:799-806.

Detection of α-Fetoprotein Using a Novel Electrochemiluminescence Immunosensor Based on Self-enhanced Ru(Ⅱ) Complex

LIAO Ni*

(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua617000，China)

self-enhanced；immunosensor；α-fetoprotein；Au nanocages；hollow gold nanospheres

2015-12-20；

2016-01-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21575116)

廖妮，碩士，助教，研究方向：納米材料與生物傳感器，Tel:0812-3370459，E-mail:707584550@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.009

O657.1；O629.7

A

1004-4957(2016)07-0832-07