何　平，鞠玲燕，崔　嘉，李兆杰，宋曉華 ，楊麗君*

(1.中國合格評定國家認可中心，北京　100062；2.威海出入境檢驗檢疫局，山東 　威?！?64200)

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雞肉凍干粉中妥曲珠利及妥曲珠利砜殘留標準樣品的研制

何平1，鞠玲燕2，崔嘉2，李兆杰2，宋曉華2，楊麗君2*

(1.中國合格評定國家認可中心，北京100062；2.威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海264200)

建立了雞肉凍干粉中妥曲珠利和妥曲珠利砜標準樣品的研制和定值方法。通過口灌給藥，使妥曲珠利在雞體內(nèi)代謝，從而使雞肉中含有一定濃度的妥曲珠利和妥曲珠利砜，經(jīng)均質(zhì)、冷凍干燥、真空封裝等處理后獲得1批852個獨立包裝的雞肉凍干粉標準樣品。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對樣品的均勻性和穩(wěn)定性進行檢測，通過8 家實驗室協(xié)作定值的方式對標準樣品進行定值和不確定度評估，最終確定妥曲珠利的標準值為(60.42±9.12) μg/kg，妥曲珠利砜的標準值為(73.10±12.48) μg/kg。結(jié)果表明樣品的均勻性良好，穩(wěn)定性長達24 個月，可用于雞肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜殘留分析的質(zhì)量控制。

標準樣品；雞肉；妥曲珠利；妥曲珠利砜；研制；定值；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

標準樣品(Reference material，RM)是一種或多種規(guī)定特性足夠均勻和穩(wěn)定的材料，已經(jīng)確定其符合測定過程的預(yù)期用途(包括測量系統(tǒng)校準、測量程序評估、給其他材料賦值和質(zhì)量控制)[1]。歐盟2002/657/EC中明確指出在獸藥殘留分析中需采用基體標準樣品進行過程控制。但國外標準樣品的價格昂貴而且訂購和運輸時間長，國內(nèi)的殘留分析實驗室無法定期用其進行質(zhì)控。我國獸藥殘留標準樣品的研究起步較晚，雖有幾家檢驗檢疫機構(gòu)開展了獸藥殘留檢測實物標準樣品的研究[2-6]，但仍未形成規(guī)?；⒊善坊臉藴蕵悠返闹苽?、生產(chǎn)、供給。我國動物源獸藥的標準樣品相當匱乏，因此研制一系列均勻性和穩(wěn)定性較好的動物源基體獸藥標準樣品具有廣闊的應(yīng)用前景。

妥曲珠利(Toltrazuil，TOL)是三嗪酮類抗球蟲藥物，因其高效、低毒、廣譜的特點，被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。妥曲珠利砜(Toltrazuril sulfone)是妥曲珠利的代謝產(chǎn)物。由于兩者在仔雞可食用組織中的殘留時間很長，停藥24 d后在雞胸肌中仍能檢出，因此，美國至20世紀末仍未批準該產(chǎn)品上市[7]。日本和歐盟規(guī)定雞肉中妥曲珠利(以妥曲珠利砜計)的最大殘留限量分別為0.9 mg/kg 和0.1 mg/kg[8]。目前，妥曲珠利和妥曲珠利砜的檢測分析通常采用加標回收實驗作為質(zhì)量控制的手段，但加標回收率難以反映出真正陽性樣品的提取效率，需采用妥曲珠利和妥曲珠利砜殘留基體標準樣品進行檢測過程控制。本研究從給藥到定值進行探討，研制出含妥曲珠利和妥曲珠利砜殘留的雞肉凍干粉基體標準樣品，填補了我國三嗪類藥物殘留基體標準樣品的空白，并以能力驗證計劃為平臺，將該基體標準樣品應(yīng)用于實驗室外部質(zhì)量控制過程。

1　實驗部分

1.1實驗動物與藥物

實驗用雞購自本地養(yǎng)雞場，選擇當?shù)爻赡耆怆u，雌雄各半，個體大小均一，體重約2.5 kg，適應(yīng)飼喂7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。實驗用雞經(jīng)檢測確認不含目標物后，取部分宰殺用作空白樣品，其余進行給藥實驗，用于制備妥曲珠利和妥曲珠利砜標準樣品。實驗用藥為市售妥曲珠利原藥粉(含量≥98%，批號20120917)，購自湖北龍翔藥業(yè)有限公司。

1.2試劑與儀器

甲醇(色譜純，美國默克公司)；乙酸乙酯、環(huán)己烷(色譜純，德國CNW公司)；無水硫酸鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，使用前需于650 ℃灼燒4 h，置于干燥器中備用。標準品：妥曲珠利(CAS：69004-03-1，純度>98.0%)、妥曲珠利砜(CAS：69004-04-2，純度>99.0%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，內(nèi)標妥曲珠利-D3(CAS：1353867-75-0，純度>98.0%)購自德國Witega公司。

Ultimate 3000高效液相色譜儀、TSQ Vantage串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermofisher公司)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(日立公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；B20-KT高速多功能攪拌機(廣東恒聯(lián)食品機械有限公司)；8411型電動振篩機(上海寶蘭實驗儀器有限公司)；YB-1000A型高速中藥粉碎機(上海力箭機械有限公司)；UM44A型粉碎混勻機(德國Stephan公司)；4 kg×25盤冷凍干燥倉(威海眾合食品有限公司)；VS-600WA真空包裝機(深圳市晟楓包裝機械有限公司)。

1.3分析方法

1.3.1樣品的前處理稱取雞肉5 g或雞肉粉1 g(雞肉粉需加4倍樣品質(zhì)量的水還原60 min)，精確至0.01 g，加入內(nèi)標溶液、25 mL乙酸乙酯和5 g無水硫酸鈉，10 000 r/min均質(zhì)提取1 min，離心，取10 mL提取液于玻璃管中，45 ℃下氮氣吹干，用乙酸乙酯-環(huán)己烷(50∶50)溶解殘渣并定容至10 mL，GPC凈化后，將收集的洗脫液蒸干，用1 mL甲醇-水(8∶2)溶解殘渣，渦旋振蕩，過0.45 μm有機濾膜，供LC-MS/MS檢測。

1.3.2液相色譜條件色譜柱：Kinetex XB-C18(2.6 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液；B為乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0～2.0 min，30%～55%B，2.0～8.5 min,55%B，8.5～8.7 min，55%～90%B，8.7～11.0 min，90%B，11.0～11.1 min，90%～30%B，11.1～15 min，30%B。

1.3.3質(zhì)譜條件電噴霧電離源正離子掃描(ESI+)；選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)；電噴霧電壓:3 200 V；離子傳輸毛細管溫度:350 ℃；加熱器溫度:350 ℃；鞘氣壓力:40 arb；輔助氣壓力:10 arb；妥曲珠利的監(jiān)測離子m/z424.0，碰撞能量(CE)為3 V，S-lens RF電壓為81 V；妥曲珠利砜的監(jiān)測離子m/z456.0，碰撞能量(CE)為5 V，S-lens RF電壓為:94 V；妥曲珠利-D3的監(jiān)測離子m/z427.0，碰撞能量(CE)為3 V，S-lens RF電壓為81 V。

1.4標準樣品的制備

妥曲珠利按照每只雞0.2 mg的藥量，藥粉裝入膠囊中，將膠囊塞至雞舌根處，讓雞自然咽下，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d，停藥后每10 h宰殺進行檢測，直至得到雞肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜的含量約為15 μg/kg，宰殺后取雞胸肉和雞腿肉，洗凈血水。按4∶1的比例加水將雞肉混勻制成肉糜，將肉糜放入真空冷凍干燥機內(nèi)，-70 ℃速凍成厚度不超過2 cm的凍塊，置于真空干燥倉中，保持48 h，直至凍塊干燥。將冷凍干燥后的肉糜取出，用高速中藥粉碎機粉碎、勻質(zhì)后的肉粉過60目孔篩，棄去篩余粗粉；聚乙烯瓶提前45 ℃烘干，放入無菌室用紫外燈滅菌，在無菌室內(nèi)準確稱量干粉置于聚乙烯瓶中，每個瓶內(nèi)雞粉的質(zhì)量6.0 g，再用鋁箔袋將包裝瓶真空封裝，隨機在外包裝順序編號，共計852瓶；-18 ℃冷凍保存，進一步做均勻性和穩(wěn)定性檢測。

1.5均勻性研究

標準樣品的特性應(yīng)當均勻，即在規(guī)定的細分范圍內(nèi)保證其特性不變。本文研制的標準樣品數(shù)量在500瓶以上，根據(jù)以往的研制經(jīng)驗，均勻性相對較好，故均勻性檢驗方案設(shè)計為每種隨機抽取15瓶，每瓶樣品中各抽取3份子樣，在相同的實驗條件下對標準樣品進行均勻性檢測，采用單因素方差分析法對樣品的均勻性數(shù)據(jù)進行處理，判斷標準樣品是否均勻[9-10]。

1.6穩(wěn)定性研究

穩(wěn)定性研究是為了確定標準樣品穩(wěn)定貯存和運輸?shù)沫h(huán)境條件。在適宜的環(huán)境條件下，標準樣品特性值應(yīng)不會隨著貯存、運輸時間的延長發(fā)生顯著變化。對于新研制的標準樣品，首先應(yīng)考察其在給定貯存條件下的長期穩(wěn)定性。當標準樣品穩(wěn)定貯存條件與標準樣品應(yīng)用時的實際運輸條件存在較大差異時，還應(yīng)考察該標準樣品在運輸過程中的短期穩(wěn)定性[9-11]。

1.6.1短期穩(wěn)定性短期穩(wěn)定性研究是確定標準樣品運輸?shù)沫h(huán)境條件。短期穩(wěn)定性實驗進行30 d，按先密后疏選6個時間點(0，2，5，9，14，30 d)，模擬運輸中遇到的極端溫度(-18，25，50 ℃ 3個溫度點)存放，每次測量隨機選擇3瓶，每瓶樣品平行分析2次，共6組數(shù)據(jù)，以3瓶的總平均值為該時間點的特性值穩(wěn)定性檢驗結(jié)果。

1.6.2長期穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性研究是確定標準樣品穩(wěn)定貯存的環(huán)境條件。時間間隔分別為0，3，6，12，18，24個月，具體方案是在每個穩(wěn)定性檢驗時間點從庫存樣品中隨機抽取3瓶樣品，每瓶樣品平行分析2次，共6組數(shù)據(jù)，以3瓶的總平均值為該時間點的特性值穩(wěn)定性檢驗結(jié)果。

1.7定值與不確定性評估

本標準樣品的定值采用8個有較高權(quán)威性的實驗室協(xié)作定值的方式進行，每個實驗室3個樣品，每個樣品做2個平行，測定數(shù)據(jù)經(jīng)過格拉布斯(Grubb's)檢驗、夏皮羅-威爾克(Shapiro-wilk)檢驗、狄克遜(Dixon)檢驗、科克倫(Cochran)檢驗后取平均結(jié)果定值。標準樣品特性值的不確定度由協(xié)作定值產(chǎn)生的不確定度，長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度，以及瓶間不均勻性產(chǎn)生的不確定度合成并擴展(包含因子k=3)而得。

圖1　給藥后雞肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜 的含量與時間曲線Fig.1　Time-concentration curves of toltrazuil and toltrazuil sulfone in chicken muscle after oral administration

2　結(jié)果與討論

2.1樣品的制備

為了保證精確給藥，本研究選擇口腔灌服給藥的方式。家禽內(nèi)服妥曲珠利后，迅速被代謝為妥曲珠利亞砜和妥曲珠利砜，但一次給藥很難將雞肉組織中兩種藥物的水平控制在同一數(shù)量級內(nèi)，因此采用連續(xù)3 d給藥方式[6]，給藥后監(jiān)測雞肉組織中妥曲珠利和妥曲珠利砜的濃度(見圖1)，選擇適宜濃度時宰殺。結(jié)果表明，停藥10 h時，肌肉組織中的部分妥曲珠利代謝為妥曲珠利砜，在此時取樣，雞肉組織中妥曲珠利和妥曲珠利砜的殘留量接近，約為15.0 μg/kg，此后妥曲珠利繼續(xù)代謝，肌肉組織中妥曲珠利砜的含量增加，而妥曲珠利含量逐漸消減。

宰殺后取樣，要求盡量避免血液與肌肉接觸，采用不易受血液污染的雞胸肉和雞腿肉，且勻漿、粉碎、過篩和冷凍干燥等過程應(yīng)嚴格控制，保證最后制得樣品的均一性。例如在凍干器壁上雞肉的涂抹厚度要適中，厚度過厚，會使凍干時間延長，而且凍塊會出現(xiàn)局部板結(jié)化，造成凍干不均勻。分裝前，分散取六點，進行均勻性初測，均勻性滿足要求后，進行無菌分裝。

2.2樣品的測定

按前述分析方法處理樣品后，得到妥曲珠利和妥曲珠利砜標準品以及雞肉凍干粉標準樣品的MRM色譜圖(如圖 2)。 由圖可見標準樣品中妥曲珠利、妥曲珠利砜以及同位素內(nèi)標與樣品中各組分良好分離，且出峰保留時間和對應(yīng)的各組分保留時間基本一致,標準樣品的目標檢測物出峰處無雜峰干擾，證明所獲取的標準樣品中存在目標檢測物，且能準確反映樣本中目標物的殘留量。

　圖2　妥曲珠利和妥曲珠利砜標準品(A)以及雞肉凍干粉標準樣品(B)的SRM色譜圖Fig.2　SRM chromatograms of toltrazuil and toltrazuil sulfone standards(A)and the reference materials in chicken muscle lyophilisates(B)

2.3均勻性研究

在均勻性檢驗過程中，一般需同時考察組間均勻性及組內(nèi)均勻性，本研究采用單因素方差分析法對樣品的均勻性數(shù)據(jù)進行處理[9-11]，結(jié)果如表1所示。根據(jù)方差分析原理，該統(tǒng)計量是自由度為(v1，v2)的F分布變量。由公式v1=m-1，v2=N-m，并已知m=15，N=3×15=45；則v1=14，v2=30，在顯著性水平α=0.05時，計算得F0.05(14,30)=1.367和1.607，查表得到F臨界值(Fcrit)=2.04，F(xiàn)值小于Fcrit值時，該樣品均勻，并將樣品的不均勻性誤差計入總的不確定度。

表1　妥曲珠利和妥曲珠利砜標準樣品的均勻性檢驗(n=3)

(續(xù)表1)

No.ToltrazuilToltrazuilsulfoneDetected/(μg·kg-1)Average/(μg·kg-1)Detected/(μg·kg-1)Average/(μg·kg-1)1259.82,58.19,56.8458.2875.90,79.95,74.9676.941358.89,61.01,62.8260.9179.83,80.83,81.5880.751458.31,56.42,59.6958.1479.88,77.42,78.9078.731562.33,61.16,63.0962.1979.67,81.72,79.2480.21P-value0.2770.186F0.05(14,30)1.3671.607Fcrit2.0372.037

2.4穩(wěn)定性研究

標準樣品穩(wěn)定性研究的基本模型是Y=β0+β1X+ε，用線性擬合模型評估標準樣品的穩(wěn)定性，以X代表時間，Y代表標準樣品中目標物的含量，ε代表隨機誤差分量，采用t檢驗法對樣品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進行處理，比較t檢驗計算值(tcal)與t檢驗臨界值(tcrit)，tcal≤tcrit時，表明標準樣品是穩(wěn)定的[9-11]。短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表2，可以看出，tcal

表2　妥曲珠利和妥曲珠利砜短期穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)(n=2)

表3　妥曲珠利和妥曲珠利砜的長期穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)(n=6)

2.5定值與不確定度評定

表4　各定值實驗室的妥曲珠利測定數(shù)據(jù)處理結(jié)果

表5　各定值實驗室的妥曲珠利砜測定數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.5.2不確定度評估以全部定值實驗室的測定結(jié)果為整體進行定值不確定度評估，考慮長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性以及樣本之間的不均勻性產(chǎn)生的不確定度，在數(shù)據(jù)檢驗滿足要求的前提下，不再單獨評估單個實驗室人員操作、儀器設(shè)備等產(chǎn)生的不確定度，以簡化不確定度的評估量，同時保證評估數(shù)據(jù)的可靠性。分析不確定度評估結(jié)果，本標準樣品的不確定度來源主要有以下方面[10，12-15]：

①標準樣品協(xié)作定值產(chǎn)生的不確定度：包括檢測方法、樣品前處理、環(huán)境設(shè)施、人員操作、儀器差異等產(chǎn)生的不確定度。uchar=s/n0.5，s為總均值標準偏差，n為實驗室數(shù)。

③短期穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度：即標準樣品在各種運輸環(huán)境下的不穩(wěn)定所產(chǎn)生的不確定度。usts=s(b1)×t,t為短期穩(wěn)定性檢驗持續(xù)的時間，s(b1)為斜率標準偏差的估計值。

在置信概率為99%時，k=3，則標準樣品的擴展不確定度為:U=kuc，不確定度結(jié)果見表6。

表6　妥曲珠利和妥曲珠利砜標準樣品的不確定度

最終確定妥曲珠利標準值為(60.42±9.12) μg/kg，妥曲珠利砜標準值為(73.10±12.48) μg/kg。

圖3　實驗室Z值分布圖Fig.3　Histogram of Z-scores of labs

2.6應(yīng)用

應(yīng)用本標準樣品成功組織了12個實驗室參與的CNAS T0785“雞肉中地克珠利、妥曲珠利和妥曲珠利砜殘留量的測定”能力驗證。以各參加實驗室檢測結(jié)果的Z比分數(shù)(Z值)作為評價其結(jié)果滿意度的依據(jù)，Z值的大小代表實驗室的結(jié)果與中位值的偏離程度，∣Z∣≤2.0為滿意結(jié)果，2.0<∣Z∣<3.0為可疑結(jié)果，∣Z∣≥3.0為不滿意結(jié)果。Z值分布的原理實際上是呈正態(tài)分布的顯著性檢驗，本次能力驗證的Z值分布見圖3。由圖3可見，本次能力驗證的數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，測試結(jié)果較為集中，無較大偏差。參加能力驗證實驗室對妥曲珠利測定結(jié)果的平均值為57.6 μg/kg，妥曲珠利砜測定結(jié)果的平均值為64.0 μg/kg，在標準樣品最終確定的標準值(妥曲珠利60.42±9.12 μg/kg、妥曲珠利砜73.10±12.48 μg/kg)范圍內(nèi)。

3　結(jié)　論

通過藥物飼養(yǎng)試驗動物，確定最佳的飼養(yǎng)條件和采集時機，獲得了預(yù)期含量的代表實際樣品原狀態(tài)的含妥曲珠利和妥曲珠利砜的雞肉凍干粉標準樣品。該標準樣品適用于妥曲珠利和妥曲珠利砜殘留分析質(zhì)量控制，填補了我國抗球蟲類獸藥基體標準樣品的空白，對進一步開展各類殘留檢測用基體標準樣品的研制工作具有重要意義。

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Preparation and Certification of Reference Materials for Toltrazuil and Toltrazuil Sulfone in Chicken Lyophilisates

HE Ping1，JU Ling-yan2，CUI Jia2，LI Zhao-jie2，SONG Xiao-hua2，YANG Li-jun2*

(1.China National Accreditation Service for Conformity Assessment,Beijing100062,China；2.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai264200,China)

A method for preparing and certifying the reference materials of toltrazuil and toltrazuil sulfone in chicken muscle lyophilisates was presented.Toltrazuil was accessed to chicken by oral administration.With the metabolism of toltrazuil in chiken,a certain concentration of toltrazuil and toltrazuil sulfone were obtained in the muscles.Lyophilization of the muscles was performed in one batch,and 852 bags of samples were obtained by the procedure of homogenation，cryodesiccation and vacuum-packaging.The homogeneity and stability of the sample were examined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The value of the chemical constituent of the sample was certified through the collaborative analysis program participated by 8 laboratories,and the uncertainty was evaluated.The standard values of standard samples were certified as(60.42±9.12)μg/kg for toltrazuil and (73.10±12.48)μg/kg for toltrazuil sulfone.The results showed that good homogeneity and stability of the sample reached up to 24 months,and could be used for the quality control of toltrazuil and toltrazuil sulfone residue in chicken.

reference materials; chicken; toltrazuil; toltrazuil sulfone;preparation;certification；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2015-11-23；

2016-01-07

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201310143)

楊麗君，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全,Tel:0631-3807680，E-mail:yihan82527@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.006

O657.7;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0811-08