劉穎慧，張經(jīng)華，王明林，法蕓（.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 708； .中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，生物燃料重點實驗室，山東青島 660； .北京市科學(xué)技術(shù)研究院理化分析測試中心，北京 00094）

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二維閥切換離子色譜法測定海帶中游離氨基酸*

劉穎慧1，2，張經(jīng)華3，王明林1，法蕓2
（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018； 2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，生物燃料重點實驗室，山東青島 266101； 3.北京市科學(xué)技術(shù)研究院理化分析測試中心，北京 100094）

建立一種測定海帶中游離氨基酸的閥切換高效陰離子交換色譜耦合脈沖安培檢測器法。采用一根陽離子交換柱對氨基酸進(jìn)行富集，而后經(jīng)閥切換至氨基酸分析柱AminoPac?PA-10（250 mm×2 mm）上分離并進(jìn)入安培檢測器檢測。在最佳分離條件下，20種氨基酸的質(zhì)量濃度在0.1～20.0 mg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2>0.99，20種氨基酸的檢出限為0.01 mg/L，加標(biāo)回收率為83.12%～117.34%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏為1.02%～13.05% （n=8）。該方法樣品前處理簡單，無基底雜質(zhì)干擾，適用于海帶樣品中游離氨基酸的測定。

閥切換離子色譜法；脈沖安培檢測器；陽離子交換柱；游離氨基酸；海帶

海帶是一種低溫生長的大型海生褐藻類植物，富含豐富的生理活性多糖，包括褐藻膠，巖藻糖膠及褐藻淀粉等［1-2］。因其具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，一直是現(xiàn)代食品藥品工業(yè)研究的對象［3］。海帶中的多種游離氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸等是海帶濃縮調(diào)味汁的主要成分，是重要的海鮮調(diào)味料的呈鮮味物質(zhì)［4］；海帶渣作為鮑的主要飼料，其氨基酸組成直接影響著鮑的品質(zhì)和口感［5］。對海帶中游離氨基酸的研究，有利于海帶產(chǎn)品附加值的開發(fā)，更好的發(fā)揮海帶成本低廉、應(yīng)用廣泛的優(yōu)點，也為海鮮食品工業(yè)的長足發(fā)展提供新的可能［6］。

氨基酸的研究方法有高效液相色譜法［7］、氣相色譜法［8］、毛細(xì)管電泳［9］、氨基酸分析法［10-11］等，但這些方法都各有弊端，高效液相色譜和氨基酸分析儀常常需要柱前柱后衍生化［12-13］，過程較為繁瑣，誤差比較大；而毛細(xì)管電泳和氣相色譜則對分析條件要求比較高［14-15］。近年來，隨著離子色譜的普及，離子交換色譜耦合脈沖安培檢測器在檢測氨基酸方面應(yīng)用越來越廣泛，具有專門的氨基酸分析柱（AminoPac?PA-10），耐酸堿，檢出限為0.01 mg/L，無需衍生化且靈敏度高、選擇性好，已被廣泛應(yīng)用于糖和氨基酸的檢測［16］。

由于糖在氨基酸的波形下會有電化學(xué)響應(yīng)，因此對混合溶液中氨基酸的檢測經(jīng)常會受到糖的干擾，為了有效降低糖對氨基酸分析的影響，筆者選用一種陽離子交換柱CRC對氨基酸進(jìn)行捕集，建立了一種簡單的閥切換離子色譜方法，通過閥切換對捕集后的氨基酸進(jìn)行分析，有效避免了糖在氨基酸波形下對氨基酸分析的干擾。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS-3000型，配有AS40自動進(jìn)樣器，兩個六通閥，兩個四元梯度淋洗泵，電化學(xué)檢測器ED，Chromeleon 6.80 色譜工作站，美國Thermo Fisher Scientific 公司；

超純水制備儀：Milli-Q?Advantage A10 型，美國Millipore 公司；

氫氧化鈉溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，比利時Acros Organics 公司；

乙酸鈉溶液：分析純，美國Sigma-Aldrich 公司；

甲酸溶液：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)有限公司；

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸：純度大于99.9%美國AccuStandard 公司；

實驗用水為電阻率18 M?·cm 的超純水，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾；

海帶溶液：自制（干海帶購自當(dāng)?shù)爻校?/p>

1.2樣品前處理

取新鮮曬干海帶，用超純水沖洗4～5次，晾干，于50℃烘箱烘24 h，破碎，稱取0.1 g（精確至0.1 mg）破碎后的樣品，溶解于10 mL容量瓶中，定容，震蕩10 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm水相濾膜過濾，待測。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.1 mg）經(jīng)干燥至恒重的精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容于10 mL容量瓶中，制得1 000 mg/L的精氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。以同樣方法配制相同濃度的其它19種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

用移液槍分別準(zhǔn)確稱取1，5，10，20，50，100，200，500，1 000 μL上述20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 mg/L。

1.4色譜條件

色譜柱：AminoPac?PA-10柱［分析柱（250 mm×2 mm），保護(hù)柱（50 mm×2 mm），美國Thermo Scientific公司］；淋洗液：800 mmol/L氫氧化鈉溶液，1 mol/L乙酸鈉溶液，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：32℃；采用Chromeleon 6.8色譜軟件自動控制和數(shù)據(jù)處理，積分脈沖安培檢測器；金工作電極，Ag/AgCl參比電極；檢測電位波形數(shù)據(jù)見表2。

表1　氨基酸梯度淋洗程序

1.5閥切換流程

進(jìn)樣和捕集狀態(tài)、分離和檢測狀態(tài)的閥切換流程圖分別見圖1和圖2。

圖1　閥切換流程圖（進(jìn)樣和捕集狀態(tài)）

圖2　閥切換流程圖（分離和檢測狀態(tài)）

閥切換步驟如下：

（1）樣品進(jìn)樣。自動進(jìn)樣器將定量環(huán)打滿，樣品被自動進(jìn)樣器帶入定量環(huán)1中，定量環(huán)1被充滿，多余的樣品流入廢液中。

（2）捕集階段。從0 min開始，定量環(huán)1中的樣品隨著泵A中的甲酸被帶到第二個閥中的陽離子交換柱CRC上，在1.2 min時完成氨基酸的捕集，糖不被保留進(jìn)入廢液中，氨基酸和糖實現(xiàn)分離。

（3）洗脫和檢測。從第1.2 min開始，CRC中的氨基酸被泵B中的淋洗液帶到氨基酸分析柱上分離，隨后進(jìn)入電化學(xué)檢測器進(jìn)行檢測，采集色譜圖。

2　結(jié)果與討論

2.1洗脫液的選擇與優(yōu)化

氨基酸是兩性分子，在酸性條件下，氨基酸可以形成陽離子H3+N-CHR-COOH（AA+）。AA+與強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂作用，可被吸附在樹脂上。而糖（碳水化合物）是非常弱的酸，在酸性條件下很穩(wěn)定，與強(qiáng)酸性陽離子作用很弱。因此本實驗選用甲酸作為洗脫液，選用陽離子交換柱（CRC）作為捕集柱，提供酸性條件，使氨基酸在陽離子交換柱上實現(xiàn)吸附保留，糖不被保留，從而實現(xiàn)閥切換對氨基酸和糖的分離。由于天冬氨酸最先從陽離子交換柱上被洗脫，而葡萄糖是糖類物質(zhì)中最后一個從陽離子交換柱被洗脫的糖，故選用10 mg/L的天冬氨酸與20 mg/L的葡萄糖作為氨基酸和糖的分離代表物質(zhì)，得出甲酸在濃度3 mmol/L、流量0.1 mL/min時氨基酸被捕集的最佳條件。

2.2閥切換時間優(yōu)化

以10 mg/L的天冬氨酸與20 mg/L的葡萄糖作為樣品進(jìn)行閥切換時間摸索試驗，試驗發(fā)現(xiàn)，在1.2 min時閥切換天冬氨酸和葡萄糖的捕集和洗脫效果最好，因此實驗選擇第2個閥的閥切換時間為1.2 min。

2.3線性方程和線性范圍

逐級稀釋20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別得到0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣體積為25 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行線性回歸。20種氨基酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。

表3　線性相關(guān)系數(shù)、回歸方程、線性范圍

2.4精密度和加標(biāo)回收試驗

對2 mg/L的20種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣8次，測定結(jié)果見表4。取海帶樣品，按1.2中方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)樣測定，并分別在樣品中加入0.5，1，10 mg/L 3個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗，計算平均加標(biāo)回收率，結(jié)果列于見表4。由表4可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%～13.05%，平均加標(biāo)回收率在83.12%～117.34%之間，可見方法的精密度和準(zhǔn)確度較高，滿足檢測要求。

表4　加標(biāo)回收及精密度結(jié)果（n=8） %

2.5樣品測定

按1.2方法對海帶樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果見表5。由表5可知，海帶樣品中共測出游離氨基酸10種，其中主要成分為賴氨酸和亮氨酸，含量分別為6.427 0 mg/L和13.085 4 mg/L。標(biāo)準(zhǔn)樣品及海帶樣品的離子色譜圖見圖3。

表5　海帶中游離氨基酸測定結(jié)果

圖3　20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和海帶樣品的離子色譜圖

3　結(jié)語

采用閥切換離子色譜法對混合樣品中氨基酸進(jìn)行測定，在傳統(tǒng)離子色譜方法基礎(chǔ)上添加一步閥切換程序，有效地去除基底雜質(zhì)糖類化合物對氨基酸分析的影響，提高了氨基酸檢測的準(zhǔn)確性。該法較其它檢測方法便捷，流動相為氫氧化鈉和乙酸鈉，沒有污染。方法前處理簡單，準(zhǔn)確度、精密度高，適用于海帶樣品中游離氨基酸的測定。

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Determination of Free Amino Acids of Kelp by 2D Valve-Switching Ion Chromatography

Liu Yinghui1， 2， Zhang Jinghua3， Wang Minglin1， Fa Yun2，
（1. College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2. Bioenergy and Bioprocess Technology， Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China；3.Beijing Academy of Science and Technology，Beijing 100094， China）

A valve-switching high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection was developed for the determination of free amino acids in kelp. After being enriched in CRC column， amino acids were cut into amino acid analysis column AminoPac?PA10 （250 mm×2 mm）， and then were detected on the ampere detector. Under the optimized conditions，the concentration of 20 amino acids was linear with chromatographic peak area in the range of 0.1-20.0 mg/L （r2>0.99）. The detection limit （LOD） of 20 amino acids was 0.01 mg/L. The recoveries were 83.12%-117.34%，the relative standard deviations of the detection results were 1.02%-13.05%（n=8）. The method has advantages that sample treatment is simple，no matrix interference，it is suitable for the determination of free amino acids in kelp.

valve-switching ion chromatography；pulsed ampere detector； cation exchange column；free amino acid；kelp

O657.7

A

1008-6145（2016）04-0023-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.006

*國家自然科學(xué)基金項目（21405166）；科技部重大科學(xué)儀器開發(fā)專項（2012YQ090229）

聯(lián)系人：法蕓；E-mail: fayun@qibebt.ac.cn

2016-04-05