鄒小輝 郭小娟 王敏 屈建國 魯茁壯 洪濤

100052北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

·技術(shù)方法·

GFP標(biāo)記 IX蛋白的重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定

鄒小輝 郭小娟 王敏 屈建國 魯茁壯 洪濤

100052北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

目的 為了更加直觀地觀察腺病毒（Adenovirus，Ad）與細(xì)胞之間的相互作用，本研究擬構(gòu)建一株經(jīng)綠色熒光蛋白（Green F1uorescent Protein，GFP）標(biāo)記（pIX）蛋白的5型重組腺病毒（Ad5-IXGFP）。方法 我們將GFP基因構(gòu)建至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShutt1e中IX基因3'端，通過與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183細(xì)菌內(nèi)的同源重組，獲得了重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-IXGFP。將pAd5-IXGFP質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，拯救出重組腺病毒Ad5-IXGFP。結(jié)果 經(jīng)擴(kuò)增和超速離心純化后可獲得濃度為6.9×1011vp/m1的重組腺病毒。該病毒于4℃與HEp-2細(xì)胞孵育后，重組病毒吸附于HEp-2細(xì)胞表面，用熒光顯微鏡觀察，可見綠色熒光。結(jié)論 利用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)重組腺病毒外殼蛋白pIX進(jìn)行修飾，成功制備的經(jīng)GFP標(biāo)記的重組腺病毒可用于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤腺病毒顆粒感染細(xì)胞的過程。

【主題詞】 腺病毒；衣殼蛋白IX；綠色熒光蛋白；熒光標(biāo)記

Fund program：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（31400156）

腺病毒（Adenovirus，Ad）是直徑為約90 nm的正二十面體無包膜病毒，其主要衣殼蛋白包括五鄰體、六鄰體及纖維蛋白；次要衣殼蛋白包括VI，VIII，IX，IIIa蛋白［1］。人5型腺病毒（Ad5）感染細(xì)胞的過程中，五鄰體的Fiber介導(dǎo)病毒吸附到細(xì)胞表面，同時(shí)五鄰體基上的 RGD基序（Arginine-G1ycine-Aspartate peptide）識(shí)別細(xì)胞表面的αVβ3，αVβ5次受體。病毒由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，病毒顆粒從胞內(nèi)體釋放到細(xì)胞漿中，并在動(dòng)力蛋白的驅(qū)動(dòng)下沿著微管運(yùn)輸?shù)轿⒐芙M織中心或者細(xì)胞核外表面，在核孔復(fù)合物釋放IX蛋白與六鄰體蛋白，同時(shí)Adv基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，IX蛋白與六鄰體蛋白幾乎是最后從病毒衣殼上脫落的蛋白組分［2］。

表1　PCR擴(kuò)增用引物Tab.1 Primers used for PCR

在腺病毒科的4個(gè)屬中，病毒IX基因只存在于哺乳動(dòng)物腺病毒屬［3］，在其余的禽類腺病毒屬、富AT腺病毒屬和唾液酸酶腺病毒屬三個(gè)屬中并沒有發(fā)現(xiàn)其同源序列。另外，pIX還具有轉(zhuǎn)錄因子活性，對(duì)腺病毒的E1A、E4、晚期啟動(dòng)子和某些宿主細(xì)胞的基因表達(dá)具有調(diào)控作用［4］；最近的研究表膽外殼蛋白pIX與kinesin的輕鏈結(jié)合，介導(dǎo)逃離內(nèi)吞體后腺病毒向核周的運(yùn)輸［5］。但pIX是否與腺病毒基因組一同進(jìn)入細(xì)胞核目前還不清楚（進(jìn)入細(xì)胞核的pIX有可能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性）。這里我們?cè)噲D構(gòu)建GFP標(biāo)記pIX的重組5型腺病毒，為研究腺病毒進(jìn)入細(xì)胞后pIX的亞細(xì)胞定位打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 質(zhì)粒pSh5-GFP、293細(xì)胞、HEp-2細(xì)胞，病毒Ad5-GFP為本室保存［6］，Adeasy系統(tǒng)（包括pShutt1e質(zhì)粒、pAdeasy-1質(zhì)粒和E.coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞）購自美國 Stratagene公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為美國Life Techno1ogies公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶Bgl II、BstX I、Pme I、Pac I為美國NEB公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）為美國Hyc1one公司產(chǎn)品。PCR引物為使用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)，序列信息見表1，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2載體構(gòu)建 以質(zhì)粒pShutt1e為模板，以1406 IXSOGF1與1504A5IXG-R1為引物，擴(kuò)增556 bp的片段；以 pSh5GFP為模板，以 1504A5IXG-F2與1504A5IXG-R2為引物，擴(kuò)增 782 bp的片段；以pShutt1e為模板，以1504A5IXG-F3與1406SOGR3為引物，擴(kuò)增619 bp片段。上述3條片段混合作為模板，以1406IXSOGF1與1406IXSOGR3為引物，擴(kuò)增含有HAdV-5病毒結(jié)構(gòu)蛋白IX的部分基因與完整GFP基因的1 878 bp片段，該片段經(jīng)Bgl II與BstX I雙酶切，然后與經(jīng)同樣雙酶切的pShutt1e載體連接，得到IX編碼區(qū)3'端融合GFP基因的pSh5-IXGFP質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序正確的pSh5-IXGFP質(zhì)粒經(jīng)Pme I雙酶切進(jìn)行線性化，電泳回收后與pAdeasy-1質(zhì)粒在E.coliBJ5183內(nèi)重組，得到 pAd5-IXGFP腺病毒質(zhì)粒。

1.3Ad5-IXGFP病毒拯救 經(jīng) PacI線性化的pAd5-IXGFP DNA用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含2%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察有綠色熒光聚集現(xiàn)象，或者用普通倒置顯微鏡觀察有噬斑時(shí)，將培養(yǎng)瓶移至 -80℃冰箱，凍融3次后，12000 g離心3 min，回收上清作為第1代種子病毒，于-80℃凍存。

1.4重組腺病毒Ad5-IXGFP的擴(kuò)增與純化 將種子病毒Ad5-IXGFP接種293細(xì)胞，吸附6～8 h后更換含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)完全細(xì)胞病變（cytopathic effec，CPE）后，按1.3方法收取第2代種子病毒。病毒經(jīng)過4次傳代后，將最終獲得的病毒上清用氯化銫密度梯度離心進(jìn)行純化，經(jīng)消化法測(cè)定滴度［6］，于-80℃凍存。

1.5重組腺病毒Ad5-IXGFP的鑒定 純化病毒再次感染293細(xì)胞，48 h后經(jīng)Hirt法提取病毒基因組，以 1509IXGFP-F與 1509IXGFP-R為引物或1207GFP-F與1207GFP-R為引物，PCR方法驗(yàn)證Ad5-IXGFP病毒基因組（圖1）中IX與GFP基因融合情況，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸110 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

圖1　腺病毒Ad5-IXGFP與Ad5-GFP基因組示意圖Fig.1 Schematic representation of the genomes of Ad5-IXGFP and Ad5-GFP

1.6熒光顯微鏡觀察Ad5-IXGFP病毒在細(xì)胞表面的吸附 使用胰酶消化對(duì)數(shù)生長的HEp-2細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在含1%FBS DMEM培養(yǎng)基中以20 000 MOI（感染復(fù)數(shù)，vp/ce11）吸附 Ad5-GFP或 Ad5-IXGFP病毒。在冰水浴條件下，病毒吸附5 h后（每1-2 h振搖1次），在病毒-細(xì)胞混合液中直接加入10倍體積的含1%甲醛的PBS溶液，室溫固定30 min，300 g離心5 min，棄大部分上清，保留少許上清重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面吸附病毒的情況。

2 結(jié)果

2.1重組腺病毒Ad5-IXGFP病毒的拯救 pAd5-IXGFP經(jīng)Pac I酶切線性化并經(jīng)乙醇沉淀回收后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察，48 h后可見較少綠色熒光，11 d后熒光細(xì)胞數(shù)量增多，局部區(qū)域形成熒光灶，但并未見噬斑形成。將收獲的第1代種子病毒感染新鮮293細(xì)胞，感染后3 d可見細(xì)胞出現(xiàn)較多熒光聚集現(xiàn)象，表明重組Ad5-IXGFP病毒拯救成功并能夠在293細(xì)胞中增殖。

2.2Ad5-IXGFP病毒的純化與鑒定 將拯救成功的Ad5-IXGFP病毒繼續(xù)感染293細(xì)胞，傳代4次擴(kuò)增至5個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑150 mm），收獲病毒并進(jìn)行CsC1密度梯度離心純化，得到純化病毒約1.0 m1，消化法測(cè)得其滴度為6.9×1011vp/m1。采用PCR法對(duì)Ad5-IXGFP病毒基因組中IX-GFP基因的融合情況進(jìn)行鑒定。以1207GFP-F和1207GFP-R為引物時(shí)，Ad5-IXGFP與Ad5-GFP病毒基因組中均能擴(kuò)增出404 bp的目的片段，表明2種病毒均含有GFP基因。分別在IX序列與GFP序列中設(shè)計(jì)上下游引物，經(jīng)PCR對(duì)Ad5-IXGFP病毒基因組擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期的1 188 bp大小相符；而以Ad5-GFP病毒基因組作為模板時(shí)并未見擴(kuò)增產(chǎn)物，表明Ad5-IXGFP病毒基因組中GFP融合于IX基因3'端（圖2）。

IX-G：以1509IXGFP-F和1509IXGFP-R為引物；GFP：以1207GFP-F和1207GFP-R為引物；5-IX：以Ad5-IXGFP病毒基因組DNA為模板；5-G：以Ad5-GFP病毒基因組DNA為模板；M：DL2000 DNA Marker圖2　Ad5-IXGFP重組腺病毒基因組的鑒定IX-G：primers of 1509IXGFP-F and 1509IXGFP-R，GFP：primers of 1207GFP-F and 1207GFP-R.5-IX：genomic DNA of Ad5-IXGFP，5-G：genomic DNA of Ad5-GFP.M：DL2000 DNA MarkerFig.2 Identification of the genome of recombinant Ad5-IXGFP with PCR

2.3Ad5-IXGFP病毒對(duì)細(xì)胞的吸附 將 Ad5-IXGFP病毒與HEp-2細(xì)胞于4℃孵育5 h后，可以在熒光顯微鏡下看到HEp-2細(xì)胞周圍出現(xiàn)較強(qiáng)熒光（圖3），而經(jīng)Ad5-GFP處理的HEp-2細(xì)胞及未經(jīng)病毒感染的HEp-2細(xì)胞卻未見熒光。表明本研究構(gòu)建的Ad5-IXGFP病毒吸附到細(xì)胞表面后，IX蛋白攜帶的GFP能夠被熒光顯微鏡解析。

3 討論

本研究利用重疊延伸PCR，在AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)的pShutt1e質(zhì)粒右臂pIX基因下游插入GFP編碼框，使得獲得的重組病毒表達(dá)pIX-GFP融合蛋白（GFP位于融合蛋白C端），由于pIX的N端是插入病毒顆粒外殼的部位，而C端游離于病毒顆粒外表面，表達(dá)的pIX-GFP融合蛋白能夠組裝到病毒顆粒外殼，從而使得重組病毒帶有GFP標(biāo)簽。HEp-2病毒吸附實(shí)驗(yàn)證明重組病毒能夠吸附到靶細(xì)胞，并且病毒顆粒自身攜帶有GFP標(biāo)簽，說明我們成功構(gòu)建了GFP標(biāo)記的重組腺病毒。

Ad5-GFP或Ad5-IXGFP病毒分別以20 000 MOI（感染復(fù)數(shù)，vp/ce11）與HEp-2細(xì)胞于4℃孵育5 h后，經(jīng)1%甲醛的PBS溶液，室溫固定30 min后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面吸附病毒的情況。圖3　熒光顯微鏡觀察Ad5-IXGFP病毒對(duì)HEp-2細(xì)胞的吸附HEp-2 ce11s were dispersed into suspended sing1e ce11s after trypsin treatment and were incubated with Ad5-IXGFP or Ad5-GFP at a mu1tip1icity of infection（MOI）of 20 000 for 5 h at 4℃，respective1y.The ce11s were then fixed with 1% forma1dehyde and visua1ized under f1uorescence microscope.Fig.3 Visua1ization of the attachment of Ad5-IXGFP on the surface of HEp-2 ce11s under f1uorescence microscope

pIX是一個(gè)含有140個(gè)氨基酸殘基的多肽，表達(dá)于病毒復(fù)制的中期，pIX基因具有獨(dú)立的啟動(dòng)子，是唯一不受主要晚期啟動(dòng)子（MLP）調(diào)控的結(jié)構(gòu)蛋白。pIX具有轉(zhuǎn)錄因子活性，在病毒復(fù)制過程中參與調(diào)控病毒和細(xì)胞基因表達(dá)。作為結(jié)構(gòu)蛋白，pIX錨定六鄰體結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定病毒粒子的作用；在病毒進(jìn)入細(xì)胞、逃離內(nèi)吞體后，pIX參與病毒粒子的細(xì)胞漿運(yùn)輸，在將病毒基因組轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核的過程中發(fā)揮重要作用［5］。但pIX是否與病毒基因組一同進(jìn)入細(xì)胞核，目前還不完全清楚［4，7］。我們構(gòu)建了 GFP標(biāo)記pIX的重組病毒，為進(jìn)一步研究病毒進(jìn)入細(xì)胞后pIX的亞細(xì)胞定位打下了基礎(chǔ)。

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Construction and identification of recombinant adenovirus with GFP labeled protein I
X

ZouXiaohui，Guo Xiaojuan，Wang Min，Qu Jianguo，Lu Zhuozhuang，Hong Tao National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100052，China

Lu Zhuozhuang，Email：luzz@ivdc.chinacdc.cn

Objective To study the ro1e of protein IX（pIX）in the interaction between adenovirus and host ce11 dynamica11y，we attempt to construct a recombinant human adenovirus with the capsid protein pIX being 1abe11ed with Green F1uorescent Protein（GFP）.Methods GFP gene was inserted into the downstream of pIX genein the shutt1e p1asmid to form pShutt1e-IXGFP；and adenovira1 p1asmid pAd5-IXGFP was generated by homo1ogous recombination of pShutt1e-IXGFP with the backbone p1asmid（pAdeasy-1）in E.coli BJ5183 strain.Recombinant adenovirus（Ad5-IXGFP）was rescued by transfecting 293 ce11s with the 1inearized pAd5-IXGFP.Results After 4 rounds of propagation in 293 ce11s，viruses were purified with CsC1 u1tracentrifugation method.Ad5-IXGFP in 1.0 m1 with a partic1e titer of 6.9×1011vp/m1 was fina11y obtained.PCR was performed to confirm the fusion of IX with GFP gene in the genome of Ad5-IXGFP. Virions were incubated with suspended HEp-2 ce11s at 4℃ for 5 h，and the attachment of Ad5-IXGFP on the ce11u1ar membrane cou1d be observedunderf1uorescencemicroscope.ConclusionGFP-1abe11ed recombinant adenovirus was successfu11y constructed，which cou1d be a va1uab1e too1 for subce11u1ar 1oca1ization fo pIX after virus entry rea1-time sing1e adenovirus tracking by confoca1 f1uorescence microscopy.

Adenovirus；capsid protein IX；GFP；f1uorescent 1abe1ing

國家自然科學(xué)基金（31400156）

魯茁壯，Emai1：1uzz@ivdc.chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.023

2015-12-01）