謝華萍 耿進妹 劉靜雯 陳純 蔡文鋒 狄飚 袁俊

510440廣州市疾病預防控制中心

2012-2013年廣州市5起胃腸炎暴發(fā)中諾如病毒的分子流行病學特征

謝華萍 耿進妹 劉靜雯 陳純 蔡文鋒 狄飚 袁俊

510440廣州市疾病預防控制中心

目的 了解2012年12月至2013年1月期間我國廣州5起胃腸炎暴發(fā)諾如病毒的分子流行病學特征。方法 收集2012年12月至2013年1月廣州市5起胃腸炎暴發(fā)（A-E）共274份糞便標本和流行病學資料，利用RT-PCR方法對諾如病毒進行檢測，對擴增產(chǎn)物進行序列測定。用C1usta1 X 1.83和MEGA 5.05生物軟件對諾如病毒序列進行序列比對和系統(tǒng)進化分析。用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果 諾如病毒的總陽性率為20.07%（55/274），其中，A高校諾如病毒陽性率為8.70%（2/23）、B幼兒園為36.36%（8/22）、C高校為36.07%（22/61）、D社區(qū)衛(wèi)生中心為100% （5/5）、E高校為11.04%（18/163），60歲及以上年齡組諾如病毒陽性率為100%（6/6），10-19歲年齡組為47.37%（9/19），9歲及以下年齡組為36.36%（8/22）。系統(tǒng)進化分析表明33份成功分型的陽性標本均為諾如病毒GⅡ.4型新變異株Sydney 2012感染。結論 諾如病毒是引起廣州市急性胃腸炎暴發(fā)的主要病原之一，GⅡ.4型新變異株Sydney 2012是當年流行的優(yōu)勢毒株。

【主題詞】 諾如病毒；急性胃腸炎；暴發(fā)；Sydney 2012變異株

【Key words】Norovirus；Acute gastroenteritis；Outbreak；Sydney 2012 variant

Fund programs：Key Medicine Discip1ine Construction of Guangzhou Municipa1ity（2013-2015-07）；Guangzhou Medica1 and Hea1th Science and Techno1ogy Project（20151A011057）

人諾如病毒屬于杯狀病毒科，是導致世界范圍內胃腸炎暴發(fā)的主要病原，尤其是在醫(yī)院、學校、監(jiān)獄、養(yǎng)老院等相對封閉的環(huán)境。其流行在全世界范圍內造成了較高的發(fā)病率、病死率以及嚴重的經(jīng)濟負擔［1］，尤以兒童、老年人、免疫抑制人群和免疫缺陷人群為主［2］。

諾如病毒是單鏈正股RNA病毒，基因組長度約7.5～7.7 kb，5′末端為一帽狀結構，3′末端為多聚A尾。根據(jù)其VP1區(qū)或RdRp區(qū)核苷酸序列的不同，諾如病毒可被分為至少6個基因組（genogroup，GIGVI），其中，GI、GⅡ、GⅣ可感染人，以GI和GⅡ組諾如病毒最為常見［3］。諾如病毒的核苷酸序列有著較大的差異，不同基因組包含許多不同的基因型，不同基因型又有許多變異株。目前至少有32種人諾如病毒基因型被確定，其中GⅡ.4型是全世界范圍內廣泛流行的主要基因型，人急性胃腸炎中有55%～85%為GⅡ.4型諾如病毒所致。自1995年以來，GⅡ.4型諾如病毒已在全球引起了許多次急性胃腸炎的暴發(fā)流行，每次均是不同的GⅡ.4型變異株所致［4］：1995-2000年為 95/96US變異株，2002-2004年為Farmington Hi11s 2002變異株，2004-2005年為Hunter 2004變異株，2006-2010年為Den Haag 2006b變異株，2009-2012年為 New Or1eans 2009變異株，2012年一種新的 GⅡ.4變異株Sydney 2012開始流行，先后在澳大利亞、美國等國家地區(qū)引起了急性胃腸炎的暴發(fā)流行［5］。

Sydney2012毒株最早于2012年3月在澳大利亞首次發(fā)現(xiàn)［6］，此后在澳大利亞和新西蘭［5］、亞洲地區(qū)［7］、歐洲地區(qū)［8］、加拿大［9］、美國［10］等國家和地區(qū)迅速播散，并取代了之前的優(yōu)勢毒株 New Or1eans 2009，引起全球急性胃腸炎暴發(fā)的增加。2012年底至2013年初，我國廣州地區(qū)發(fā)生了5起急性胃腸炎的暴發(fā)，為了解這5起暴發(fā)是否由諾如病毒Sydney 2012所致，本研究進行了相關的檢測及分析。

1 材料與方法

1.1標本收集及處理 2012年12月至2013年1月，本研究收集了高校（A、C、E）、幼兒園（B）、越秀區(qū)某衛(wèi)生服務中心（D）共5起胃腸炎暴發(fā)共274份糞便標本，標本貯存于-20℃冰箱。取100 μ1糞便上清（固體取小豌豆大?。尤?00 μ1標本處理液，漩渦震蕩混勻，室溫靜置10 min后，8000 rpm離心5 min，將得到的便懸液置于-20℃保存。

1.2核酸提取及PCR擴增 采用QIAamp Vira1 RNA提取試劑盒（德國 Qiagen公司）進行核酸提取，具體操作嚴格按照說明書進行。用 Jiang等［11］的方法檢測諾如病毒和札如病毒，所用引物名稱、擴增區(qū)域、引物序列、擴增片段大小、反應體系的配制和反應條件的設定參見文獻。

1.3克隆及測序 PCR擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證，對出現(xiàn)目的條帶的陽性產(chǎn)物，采用Qiagen公司膠回收試劑盒進行切膠回收，連接于Promega公司的克隆載體 pGEM-T easy，然后轉化E.coli DH5α（天根），用Omega公司的質粒小提試劑盒進行質粒提取，經(jīng)EcoRⅠ（Takara）單酶切鑒定后，送至上海生物工程科技有限公司測序。

1.4數(shù)據(jù)分析 在Genebank網(wǎng)站下載諾如病毒相關參考株序列，應用C1usta1 X軟件（1.83）進行序列的多重比對和分析；應用MEGA5.05軟件（http：// www.megasoftware.net/）構建系統(tǒng)進化樹。最后利用SPSS17.0軟件進行相關的統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1流行病學特征 根據(jù)RT-PCR結果，本研究274份糞便樣本中共有55份為諾如病毒感染，總陽性率為20.07%。2012年12月10日至12月19日期間，共有2起急性胃腸炎暴發(fā)，總陽性率為48.15 （13/27）；2013年1月10日至1月29日期間，共有3起暴發(fā)，總陽性率為17.00%（42/247）。

如圖1所示：5起暴發(fā)中，A高校諾如病毒陽性率為8.70%（2/23）；B幼兒園諾如病毒陽性率為36.36%（8/22）；C高校諾如病毒陽性率為36.07% （22/61）；D社區(qū)衛(wèi)生服務中心諾如病毒陽性率為100%（5/5）；E高校諾如病毒陽性率為11.04% （18/163），其中10名病例包括學生、教師和校醫(yī)，諾如病毒核酸陽性率為47.6%（10/21）；另外8名陽性來自于該校某餐廳無癥狀廚工，陽性率為29.6%（8/27）。

所有55份諾如病毒陽性病例中，男性共36例，陽性率為26.67%（36/135）；女性共19例，陽性率為13.67%（19/139）；不同性別之間諾如病毒陽性率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.211，P=0.007）。不同年齡段中，以60歲及以上年齡組陽性率最高為100%（6/6）；其次為10～19歲年齡組，陽性率為47.37%（9/19）；9歲及以下年齡組陽性率為36.36%（8/22）；不同年齡組諾如病毒陽性例數(shù)及陽性率詳見圖2。

2.2基因型別分析

圖1　不同暴發(fā)區(qū)域諾如病毒陽性率分布Fig.1 Distribution of positive detection rate of norovirus in different outbreak areas

圖2　不同年齡組諾如病毒檢出率分布Fig.2 Distribution of detection rate of norovirus in different age groups

本研究完成測序并成功分型的諾如病毒陽性標本共33份，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：所有成功分型的標本均為GⅡ.P4型Sydney 2012變異株感染。詳見圖3。

3 討論

大量的研究資料顯示，諾如病毒是引起急性胃腸炎散發(fā)的重要病原，更是引起暴發(fā)的最常見病原。由于諾如病毒變異速度快，傳染性較高，其感染劑量又低，加以傳播途徑多樣，使得其能在學校、養(yǎng)老院、監(jiān)獄、游輪等相對封閉的環(huán)境空間內迅速傳播；諾如病毒感染在全球范圍內已造成了嚴重的經(jīng)濟負擔［1］，人們對諾如病毒愈來愈加關注。因此，對急性胃腸炎暴發(fā)進行相關流行病學調查和病原監(jiān)測，對于流行株的變化、新變異株的流行及急性胃腸炎的防控有著重要的意義。眾所周知，在5歲以下兒童胃腸炎散發(fā)病例中，諾如病毒是僅次于輪狀病毒的病原，但在急性胃腸炎暴發(fā)病例中，諾如病毒更為常見。2012年12月至2013年1月，廣州市發(fā)生了5起急性胃腸炎的暴發(fā)，經(jīng)本研究檢測分析發(fā)現(xiàn)，諾如病毒在這5起暴發(fā)中均有檢出；其中，D社區(qū)衛(wèi)生服務中心的胃腸炎暴發(fā)均為諾如病毒GII.4新變異株Sydney 2012所致，B幼兒園諾如病毒陽性率為36.36%（8/22），C高校為36.07%。這些數(shù)據(jù)表明，廣州市5起胃腸炎暴發(fā)中，諾如病毒是引起暴發(fā)的主要病原之一。諾如病毒全年皆有流行，其活動度在不同季節(jié)皆可有所波動，以冬季為主［10］，而本研究中2012-2013年廣州市的5起暴發(fā)均發(fā)生在冬季，這為諾如病毒的活動度在寒冷季節(jié)增加提供了佐證。諾如病毒所致感染，以兒童、老年人、免疫低下人群為多，亦以這幾類人群癥狀為重；本研究5起胃腸炎暴發(fā)的所有病例中，以60歲及以上年齡組陽性率最高為100%（6/6）；其次為10-19歲年齡組，陽性率為47.37%（9/19）；9歲及以下年齡組陽性率為36.36%（8/22）；這些結果與國內外的研究報道相符合［1，12］。

有研究顯示，在2009-2010年美國的食源性諾如病毒暴發(fā)中，有53%的暴發(fā)的污染源來自被病毒感染的廚工［13］。在本研究中，對發(fā)生在E高校的急性胃腸炎暴發(fā)進行調查顯示，18例陽性標本分別來自10名病例和8名該校某餐廳的廚工，陽性率分別為47.6%（10/21）和29.6%（8/27）。在對該餐廳進行全面消毒清洗，將攜帶病毒的廚工調離工作崗位后，病例數(shù)逐漸減少。因此，推斷該起疫情的暴發(fā)原因可能是攜帶病毒的廚工在制作食品的過程中直接或間接污染食物而導致。

諾如病毒變異率極高，與甲型流感病毒相似，每隔2-3年便有新的變異株出現(xiàn)［14］，由于人類對新的變異株缺乏足夠的群體免疫力，使得新變異株極易引起急性胃腸炎的暴發(fā)。2005-2006年，國內外均先后出現(xiàn)了諾如病毒GⅡ.4變異株2006b的流行，此后諾如病毒GⅡ.4型2006b變異株一直是引起全球急性胃腸炎暴發(fā)的主要病原；直到2009年，美國等部分地區(qū)出現(xiàn)了GⅡ.4型Or1eans 2009變異株，逐漸取代了2006b的優(yōu)勢地位［4］；中國雖也有Or1eans 2009變異株的流行，但其并未取代2006b的優(yōu)勢地位［15］。2012年3月以來，澳大利亞等地區(qū)先后出現(xiàn)了Sydney 2012變異株的流行，并取代了之前的流行株成為新的優(yōu)勢毒株［5］；本研究中，所有成功分型的諾如病毒均為GⅡ.4型新變異株Sydney 2012，并無GⅡ.4型變異株2006b或者Or1eans 2009檢出，這說明廣州地區(qū)諾如病毒所致暴發(fā)中，GⅡ.4型新變異株Sydney 2012已成為優(yōu)勢毒株，這與國內外的研究報道相一致［16］。

圖3　諾如病毒聚合酶區(qū)系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phy1ogenetic tree of sequence of RNA po1ymerase region among norovirus in Guangzhou

總而言之，諾如病毒是導致急性胃腸炎暴發(fā)的主要病原之一，目前GⅡ.4型變異株Sydney 2012在中國已取代2006b的優(yōu)勢地位。因此，普及諾如病毒胃腸炎的認識，提高省市疾控諾如病毒常規(guī)監(jiān)測及檢測能力；同時，完善衛(wèi)生管理制度及食品加工流程，加強對食品、水衛(wèi)生的管理，嚴格監(jiān)控廚工等從業(yè)人員的健康狀況，對于諾如病毒相關胃腸炎的防控有著重要的意義。

［1］ Ha11 AJ，Curns AT，McDona1d LC，et a1.The ro1es of c1ostridium diffici1e and norovirus among gastroenteritis-associated deaths in the united states，1999-2007.C1in Infect Dis，2012，55：216-223.doi：10.1093/cid/cis386.

［2］ Payne DC，Vinje J，Szi1agyi PG，et a1.Norovirus and medica11y attended gastroenteritis in U.S.Chi1dren.N Eng1 J Med，2013，368：1121-1130.doi：10.1056/NEJMsa1206589.

［3］ Mesquita JR，Costantini VP，Cannon JL，et a1.Presence of antibodies against genogroupⅥnorovirus in humans.Viro1 J，2013，4；10：176.doi：10.1186/1743-422X-10-176.

［4］ Verhoef L，Hewitt J，Barc1ay L，et a1.Norovirus genotype profi1es associated with foodborne transmission，1999-2012. EmergInfectDis，2015，21：592-599.doi：10.3201/ eid2104.141073.

［5］ Eden JS，Hewitt J，Lim KL，et a1.The emergence and evo1ution of the nove1 epidemic norovirus GⅡ.4variant Sydney 2012. Viro1ogy，2014，450-451：106-113.doi：10.1016/j. viro1.2013.12.005.

［6］ Eden JS，Tanaka MM，Boni MF，et a1.Recombination within the pandemic norovirus GⅡ.4 1ineage.J Viro1，2013，87：6270-6282.doi：10.1128/JVI.03464-12.

［7］ Kim HS，Kim HS，Song WK.Emergence of GⅡ.4 Sydney norovirus in South Korea during the winter of 2012-2013.J Microbio1 Biotechno1，2013，23：1641-1643.doi：10.4014/ jmb.1308.08053.

［8］ Giammanco GM，De Grazia S，Tummo1o F，et a1.Norovirus G Ⅱ.4/sydney/2012 in Ita1y，winter 2012-2013.Emerg Infect Dis，2013，19：1348-1349.doi：10.3201/eid1908.130619.

［9］ Hasing ME，Lee BE，Preiksaitis JK，et a1.Emergence of a new norovirusGⅡ.4 variant and changes in the historica1 biennia1 pattern of norovirus outbreak activity in A1berta，Canada，from 2008 to 2013.J C1in Microbio1，2013，51：2204-2211.doi：10.1128/JCM.00663-13.

［10］ Vega E，Barc1ay L，Gregoricus N，et a1.Genotypic and epidemio1ogic trends of norovirus outbreaks in the United States，2009 to 2013.J C1in Microbio1，2014，52：147-155.doi：10.1128/JCM.02680-13.

［11］ Jiang X，Huang PW，Zhong WM，et a1.Design and eva1uation of a primer pair that detects both Norwa1k-and Sapporo-1ike ca1iciviruses by RT-PCR.J Viro1 Methods，1999，83：145-154. doi：10.1016/S0166-0934（99）00114-7.

［12］ 靳淼，孫軍玲，常昭瑞，等.中國2006-2007年諾如病毒胃腸炎暴發(fā)及其病原學特征分析.中華流行病學雜志，2010，31：549-553.doi：10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2010.05.017.

［13］ Centers for Disease Contro1 and Prevention（CDC）.Survei11ance for foodborne disease outbreaks—United States，2009-2010. MMWR Morb Morta1 Wk1y Rep，2013，62：41-7.doi：10.1016/ j.annemergmed.2013.04.001.

［14］ Ramani S，Atmar RL，Estes MK.Epidemio1ogy of human noroviruses and updates on vaccine deve1opment.Curr Opin Gastroentero1，2014，30：25-33.DOI：10.1097/MOG.0000000 000000022.

［15］ 王瓊，張銀輝，楊來智，等. 深圳市兒童秋冬季腹瀉諾如病毒檢測及基因型分析.中華實驗和臨床病毒學雜志，2014，28：410-412.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2014. 06.004.

［16］ Hong-ying Z，Li-min S，Wei L，et a1.Mo1ecu1ar epidemio1ogy of genogroupⅡ noroviruses infection in outpatients with acute gastroenteritis in Nanjing，China（2010-2013）.Biomed Res Int，2014，2014：620740.doi：10.1155/2014/620740.

Molecular epidemiology of Norovirus from acute gastroenteritis outbreaks in Guangzhou

XieHuaping，Geng Jinmei，Liu Jingwen，Chen Chun，Cai Wenfeng，Di Biao，Yuan Jun Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China

Xie Huaping，Email：paopaobox@163.com

Objective To understand the mo1ecu1ar epidemio1ogy of norovirus from 5 outbreaks of gastroenteritis during Dec.2012 to Jan.2013 in Guangzhou.Methods Epidemio1ogic data and specimens were co11ected from 5 gastroenteritis outbreaks in Guangzhou.274 specimens were detected for norovirus by RT-PCR methods and PCR products were sequenced.Sequence a1ignment and phy1ogenetic ana1ysis were performed by using C1usta1 X 1.83 and MEGA 5.05 programs.Statistica1 ana1ysis was performed by using SPSS 17.0 program.Results The tota1 positive rate of norovirus was 20.07%（55/274）.The positive rate was 8.70% （2/23）in University A，36.36% （8/22）in Kindergarten B，36.07% （22/61）in University C，100% （5/5）in community hea1th service center D，11.04% （18/163）in University E.The positive rate was 100% （6/6）among age group≥60 years o1d，47.37% （9/19）among 10-19 age group and 36.36% （8/22）among age group＜10 years o1d.Phy1ogenetic ana1ysis showed that 33 samp1es were infected by the new variant-Sydney 2012 of norovirus GII.4.Conclusion Norovirus was one of the main pathogens causing acute gastroenteritis outbreaks and GII.4 Sydney 2012 variant was identified as the predominant strain in Guangzhou.

廣州市醫(yī)學重點學科建設項目（2013-2015-07）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20151A011057）

謝華萍，Emai1：paopaobox@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.014

2016-02-23）