褚福祿 溫紅玲 王志玉

250012濟(jì)南，山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室（褚福祿，溫紅玲，王志玉）；250021濟(jì)南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科（褚福祿）；教育部實(shí)驗(yàn)畸形學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王志玉）

人副流感病毒3型HN糖蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)中保守氨基酸突變分析

褚福祿 溫紅玲 王志玉

250012濟(jì)南，山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室（褚福祿，溫紅玲，王志玉）；250021濟(jì)南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科（褚福祿）；教育部實(shí)驗(yàn)畸形學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王志玉）

目的 研究人副流感病毒3型（hPIV3）HN受體結(jié)合位點(diǎn)中保守氨基酸功能。方法采用定點(diǎn)突變與同源重組相結(jié)合方法將HN受體結(jié)合位點(diǎn)中的7個(gè)保守氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ），分別為R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A，各突變株在BHK-21細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并測(cè)定其免疫沉淀反應(yīng)、蛋白表達(dá)效率、促細(xì)胞融合、受體結(jié)合和神經(jīng)氨酸酶活性。結(jié)果 各突變株在BHK-21細(xì)胞內(nèi)折疊加工正常并成功轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，其膜表面蛋白表達(dá)率與野毒株相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各突變株促細(xì)胞融合活性不同程度下降，R502A降低最多，為野毒株的14.2%；各突變株受體結(jié)合活性也不同程度降低，突變株吸附豚鼠紅細(xì)胞與吸附人紅細(xì)胞的能力大體一致；各突變株神經(jīng)氨酸酶活性變化程度不同，R502A下降最多，為18.6%；E549A下降最少，為94.9%。結(jié)論 hPIV3 HN蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)中的保守氨基酸對(duì)HN的促細(xì)胞融合活性有重要作用，第502位精氨酸（R）是關(guān)鍵氨基酸。

【主題詞】 副流感病毒3型，人；HN蛋白質(zhì)；細(xì)胞融合；血細(xì)胞吸附；神經(jīng)氨酸酶

【Key words】Human parainf1uenza virus type 3；HN protein；Ce11 fusion；Hemadsorption；Neuraminidase

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（30970142，81271806）；Scientific Foundation of Innovative Research Team in Shandong University

人副流感病毒3型（human parainf1uenza virus type 3，hPIV3）是引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原［1］，也是引起老年人和免疫功能缺陷者致死的病原之一［2］，目前無特效的治療手段［3］。hPIV3感染宿主需要血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）和融合（F）蛋白共同參與。與細(xì)胞膜表面的唾液酸受體結(jié)合的HN蛋白激活F蛋白介導(dǎo)病毒包膜和宿主細(xì)胞膜融合，病毒借此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起機(jī)體感染［4］。但HN激發(fā)F蛋白促進(jìn)膜融合過程不清楚。本研究將HN蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)中的7個(gè)保守氨基酸突變?yōu)楸彼釞z測(cè)功能，表明hPIV3 HN蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)中的保守氨基酸對(duì)激發(fā)F蛋白介導(dǎo)膜融合起重要作用。

1 材料與方法

1.1病毒、質(zhì)粒、工具酶和試劑 痘苗病毒野毒株、重組株vTF7-3由Moss教授（美國國家過敏和傳染病研究所）惠贈(zèng)。pB1uescript SK（+）（pBSK+），含有hPIV3-HN，hPIV3-F和PG1NT7β-Ga1質(zhì)粒由Iorio教授（美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院）惠贈(zèng)。

1.2引物 應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。

1.3痘苗病毒-T7瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng) 每孔4×105個(gè)BHK-21細(xì)胞接種6孔板，24 h后每孔接種1 m1 1∶100稀釋的vTF7-3，37℃孵育1 h，1 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞［5］，pBSK+為陰性對(duì)照，野毒株為陽性對(duì)照。

1.4各突變株免疫沉淀反應(yīng) 各突變株與交聯(lián)在磁珠protein A（invitrogen）的小鼠抗hPIV3 HN蛋白單克隆抗體（Abcam M02122321）混合，10%SDSPAGE，曝光2 h后掃描，Perkin E1mer Cyc1one P1us分析。

1.5各突變株表達(dá)強(qiáng)度 一抗為小鼠抗hPIV3 HN蛋白單克隆抗體（1∶20稀釋），二抗為FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（中杉金橋，ZF-0312）（1∶50稀釋），Becton Dickinson流式細(xì)胞儀分析蛋白表達(dá)率（FACS）。

1.6各突變株促細(xì)胞融合活性測(cè)定 第一系列：每孔接種1 m1 1∶100稀釋的 vTF7-3，各突變體與hPIV3-F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；第二系列：每孔接種1 m1 1∶100稀釋的痘苗病毒野毒株，PG1NT7β-Ga1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；兩系列各1×105個(gè)細(xì)胞混勻加入96孔板，20 μ1上清與 130 μ1 1.5 mg/m1氯氛紅-β-D-半乳糖苷（Stratagene）反應(yīng)30 min后，570 nm酶聯(lián)免疫分光光度儀測(cè)定吸光度（A）［6］。

1.7各突變株受體結(jié)合活性測(cè)定 每孔加2%的豚鼠或人或雞的紅細(xì)胞稀釋液，4℃吸附30 min，洗滌后加0.05 mmo1/L的NH4C1溶液，靜置1 h取上清，540 nm下測(cè)定A值。

1.8神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定 每孔加0.5 m1 0.625 g/m1的唾液乳糖鈉鹽（Invitrogen），轉(zhuǎn)移至試管，加0.5 m1高碘酸（0.025 mo1/L），0.4 m1 2%的亞砷酸鈉溶液，2 m1硫代巴比妥酸溶液（0.1 mo1/L）和1 m1酸性丁醇，3000 r/min離心15 min，549 nm測(cè)定A值［9］。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建hPIV3 HN突變體 同源末端的兩個(gè)PCR產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1菌，經(jīng)DNA測(cè)序，成功構(gòu)建7個(gè)突變體。

2.2各突變株免疫沉淀反應(yīng) 各突變株泳帶寬度和速率與野毒株大體一致（圖1）。

圖1　hPIV3 HN蛋白及其突變株免疫沉淀電泳圖Note：WTHN represents wide-type HN protein of hPIV3Fig.1 E1ectrophoresis after immunoprecipitation of hPIV3 HN g1ycoprotein and its mutant proteins

2.3各突變株蛋白表達(dá)率 各突變株蛋白表達(dá)率與野毒株相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.4各突變株促細(xì)胞融合活性 消除蛋白表達(dá)效率影響，各突變株促細(xì)胞融合活性不同程度降低別（P＜0.01），R502A最低，為野毒株的14.2%，第502位精氨酸（R）是關(guān)鍵氨基酸（表2）。

2.5各突變株受體結(jié)合活性 野毒株及突變株能吸附豚鼠和人紅細(xì)胞，不能吸附雞紅細(xì)胞。各突變株吸附豚鼠紅細(xì)胞能力不同程度降低（P＜0.05），各突變株吸附人與吸附豚鼠紅細(xì)胞能力大體一致（表2）。

2.6各突變株神經(jīng)氨酸酶活性 消除蛋白表達(dá)效率影響，除E549A各突變株的神經(jīng)氨酸酶活性不同程度降低（P＜0.05）（表2）。

表1　hPIV3 HN蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)保守氨基酸突變所用引物Tab.1 PCR primer sequences used in site-directed mutagenesis of mutations in the receptor-binding domain of hPIV3 HN protein

3 討論

膜融合是hPIV3增殖與感染的關(guān)鍵步驟，也是其感染細(xì)胞的典型病理特征。hPIV3引起膜融合需要F和同源HN蛋白協(xié)同完成［8］。目前hPIV3引起膜融合機(jī)制為：HN蛋白結(jié)合唾液酸受體后其構(gòu)型改變，引起F蛋白構(gòu)型改變，F(xiàn)蛋白暴露融合肽插入細(xì)胞膜中，引起膜融合［9］。但目前對(duì)HN與受體結(jié)合后促進(jìn)F蛋白介導(dǎo)膜融合過程不清楚。

本研究對(duì)hPIV3 HN蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)中7個(gè)保守氨基酸進(jìn)行突變，突變后未影響蛋白折疊加工，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面及其表達(dá)效率與野毒株大體一致，但受體結(jié)合、神經(jīng)氨酸酶和促細(xì)胞融合活性都不同程度下降。HN蛋白受體結(jié)合活性降低可能導(dǎo)致F蛋白融合肽不能充分暴露，且神經(jīng)氨酸酶活性損失導(dǎo)致HN蛋白切割受體能力降低，HN蛋白大多與唾液酸受體連接聚集在原細(xì)胞膜不參與其他細(xì)胞膜融合，引起膜融合程度降低。R502A促細(xì)胞融合活性降低最多，為野毒株的14.2%，E549A促細(xì)胞融合活性降低最少，也損失了三分之一活性。推測(cè)HN蛋白促細(xì)胞融合活性可能與氨基酸位置有關(guān)。HN蛋白結(jié)構(gòu)具有6個(gè)β折疊，R192、D216位于第1 個(gè)β折疊，Y530、E549位于第6個(gè)β折疊，Takimoto等研究表明，第1和第6個(gè)β折疊的氨基酸位于疏水區(qū)附近，對(duì)促細(xì)胞融合活性起重要作用［11］。HN蛋白有一個(gè)“受體結(jié)合口袋”，有結(jié)合受體功能［12］。R424、R502與R192構(gòu)成的三條精氨酸側(cè)鏈位于“受體結(jié)合口袋”一端，對(duì)受體結(jié)合活性有重要作用［10］。E409通過氫鍵與Y530和R424相連，穩(wěn)定“受體結(jié)合口袋”結(jié)構(gòu)，其突變也影響HN蛋白受體結(jié)合活性。野毒株和突變株不能吸附雞紅細(xì)胞，但對(duì)豚鼠和人紅細(xì)胞的吸附能力大體一致，說明雞紅細(xì)胞與豚鼠和人紅細(xì)胞膜表面的唾液酸受體結(jié)構(gòu)不同，HN蛋白不能結(jié)合，而豚鼠和人紅細(xì)胞的的唾液酸受體結(jié)構(gòu)相似，都能結(jié)合HN蛋白。hPIV3 HN蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面時(shí)，HN蛋白與唾液酸受體相連，受體結(jié)合位點(diǎn)突變導(dǎo)致HN蛋白轉(zhuǎn)換成具有完整神經(jīng)氨酸酶活性的野毒株構(gòu)型受阻，HN蛋白無法參與以后的膜融合過程，影響膜融合程度［10］。

表2　hPIV3 HN各突變體功能測(cè)定結(jié)果Tab.2 Functiona1 ana1ysis of hPIV3 HN and its mutants

總之，hPIV3 HN蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)膜融合起重要作用。我們將進(jìn)一步完成HN蛋白其他功能區(qū)域檢測(cè)，探討hPIV3 HN蛋白促細(xì)胞融合機(jī)制。

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Mutational analysis of conserved amino acids in the receptor-binding domain of human parainfluenza virus type 3 hemagglutinin-neuraminidase protein

Chu Fulu，Wen Hongling，Wang ZhiyuDepartment of Virology，School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China（Chu FL，Wen HL，Wang ZY）；Department of Laboratory Medicine，Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China（Zhu FL）；Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education，Jinan 250012，China（Wang ZY）

Wang Zhiyu，Email：zhiyu.wang@sdu.edu.cn

Objective To determine the functions of conserved amino acids in the receptor-binding domain of human parainf1uenza virus type 3（hPIV3）hemagg1utinin-neuraminidase（HN）protein.Methods Using a PCR-based site-directed mutagenesis method and the method of homo1ogy recombination occurred in vivo to change seven conservative amino acids into a1anine respective1y，we named them as R192A，D216A，E409A，R424A，R502A，Y530A and E549A.Wi1d type（wt）and a11 mutant HN proteins were expressed on the ce11 surface of BHK-21 ce11s.Protein fo1ding and processing，ce11 surface expression，ce11 fusion efficiency，receptor binding activity and neuraminidase activity were determined.Results WT and each mutant HN protein were fo1ded and processed efficient1y and expressed on the ce11 surface of BHK-21 ce11s. There was no statistic difference of ce11 surface expression between WT and each mutant HN protein.Ce11 fusion efficiency of each mutant protein decreased to some extent，especia11y R502A to 14.2%.The binding guinea pig erythrocytes activity of each mutant protein was corresponding to its binding human erythrocytes activity.There was different neuraminidase activity among each mutant HN protein.R502A decreased most to 18.6%，but the neuraminidase activity of E549A was simi1ar to that of WT hPIV3 HN（94.9%）. Conclusion Conserved amino acids in the receptor-binding domain of hPIV3 HN protein p1ay an important ro1e in ce11 fusion.R502 is a key amino acid.

國家自然科學(xué)基金（30970142，81271806）；山東大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目

王志玉，Emai1：zhiyu.wang@sdu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.005

2013-01-13）