紀麗麗，李曉燕，，孟可，張國明，張紅明，陳英劍

β1受體阻滯劑對力竭運動大鼠心肌能量代謝變化的影響及其機制

紀麗麗1，李曉燕1，2，孟可1，張國明2，張紅明2，陳英劍3

目的 探討β1受體阻滯劑對力竭運動大鼠心肌能量代謝變化的影響及其對應(yīng)激心肌的保護機制。方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機分為對照組、一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組，每組各12只。游泳力竭后測定心肌ATP、血漿腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）濃度，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及Western blot法分析心肌線粒體解偶聯(lián)蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）表達。結(jié)果 與對照組相比，一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組血漿FFA、E、NE濃度均增高，心肌ATP含量均降低（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果表明一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組UCP2mRNA表達量較對照組分別增加64%、43%（P均＜0.05）。Western blot結(jié)果表明一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組UCP2表達量較對照組分別增加78%、42%（P均＜0.05）。相關(guān)分析顯示血漿FFA濃度與血漿E、NE水平呈顯著正相關(guān)（r=0.93，r=0.88，P＜0.01），心肌組織UCP2表達量與血漿FFA濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.98，P＜0.01）。結(jié)論 應(yīng)用β1受體阻滯劑后可降低運動應(yīng)激對心肌能量代謝的不利影響，減輕心臟負荷。

解偶聯(lián)蛋白2；心源性猝死；β1受體阻滯劑；游離脂肪酸；大鼠

運動猝死因發(fā)生突然、難于預(yù)防，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項難題，WHO和國際心臟病學(xué)會定義運動性猝死為有或無癥狀的運動員或體育鍛煉者在運動中或運動后24 h內(nèi)意外死亡［1］，其發(fā)生機制目前尚不完全明確。解偶聯(lián)蛋白2 （Uncoupling protein 2，UCP2）是一種線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白，可調(diào)節(jié)H+的跨膜轉(zhuǎn)運，消除H+在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度，解除呼吸鏈氧化磷酸化和ATP合成的耦聯(lián)，使H+氧化過程中釋出的能量轉(zhuǎn)化為熱量釋放而不生成ATP，在基礎(chǔ)代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用。β1受體阻滯劑，如美托洛爾可減弱與生理和心理負荷有關(guān)的兒茶酚胺的作用，拮抗應(yīng)激狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮對心臟的影響。本實驗通過觀察力竭運動后大鼠心肌UCP2的表達及其與心肌能量代謝變化的關(guān)系，探討運動導(dǎo)致心肌損傷的可能機制，及應(yīng)用β1受體阻滯劑美托洛爾后能否通過影響UCP2的表達，改善運動時心肌能量代謝障礙，保護應(yīng)激狀態(tài)下的心肌細胞。

1 材料與方法

1.1主要試劑 酒石酸美托洛爾（50 mg，英國阿斯利康）；亞細胞結(jié)構(gòu)線粒體提取試劑盒（武漢博士德生物）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（武漢博士德生物）；兩步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國BIO-RAD）；UCP2抗體（美國 Millipore）；抗β-Actin兔多克隆抗體（北京康為世紀生物）；山羊抗兔IgG（H+L），辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）（北京康為世紀生物）。

1.2實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠36只（由山東大學(xué)實驗動物中心提供），3月齡，體重200～250 g，所有大鼠均先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，并在3 d內(nèi)適應(yīng)性游泳3次， 15 min/次。泳池體積100× 70×80 cm，水深50 cm，水溫控制在28℃～32℃。第4 d按簡單完全隨機分組法隨機分為對照組（12只，不運動，0.5 ml/d/只生理鹽水灌胃，維持7 d），一次力竭組（12只，不運動，0.5 ml/d/只生理鹽水灌胃，維持7 d，第8 d進行一次力竭運動），一次力竭+倍他樂克治療組（12只，酒石酸美托洛爾50 mg溶于10 mL生理鹽水，根據(jù)體重為50 kg的成人使用劑量及大鼠體重換算后，以2.5 mg/d/只灌胃，維持7 d，第8 d進行一次力竭運動）。力竭標準：大鼠沉入水底超過10 s或游泳動作明顯不協(xié)調(diào)，撈出后無逃避反應(yīng)且無法完成翻正反射［2］。

1.3大鼠血漿游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）濃度測定 第8 d游泳大鼠達力竭狀態(tài)后立即處死取血離心得血漿，于濟南軍區(qū)總醫(yī)院生化室全自動生化檢測儀檢測大鼠血漿FFA濃度。

1.4大鼠血漿腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）濃度，心肌組織ATP含量測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定上述指標，其中ATP測定先取大鼠心肌組織加入一定量磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（PH 7.4）勻漿后3000 r/ min離心20 min后取上清。按說明書進行ELISA反應(yīng)，底物在辣根過氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色，且顏色的深淺與樣品中待測物濃度呈正相關(guān)，在450 nm波長下測定OD值，根據(jù)標準品和樣本的OD值，計算得樣本中E、NE濃度和ATP含量。

1.5實時熒光定量RT-PCR測定大鼠心肌線粒體中UCP2mRNA表達 Trizol法提取心肌總RNA并測定其濃度及純度。根據(jù)GenBank上發(fā)表的UCP2序列設(shè)計熒光定量PCR引物：上游5’-CAAGA CCATTGCACGAGAGG-3’，下游5’-CCCGAA GGCAGAAGTGAAG-3’，退火溫度59℃，共40個循環(huán)。內(nèi)參β-actin熒光定量PCR引物序列：上游5’TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，退火溫度為59℃，共40個循環(huán)。取同一樣本總RNA 1μL進行RT-PCR反應(yīng)。

1.6Western blot測定大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達 取大鼠心肌組織約200 mg低溫差速離心法提取線粒體，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法測定線粒體總蛋白含量。進行10%SDSPAGE電泳，上樣量體積含50μg蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉各90 min，然后加入1:1000的一抗稀釋液4℃封閉過夜。TBST洗3遍，然后加入1:10000的辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液37℃孵育90 min后進行化學(xué)發(fā)光顯影。凝膠分析用Quantity One計算條帶光密度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠心肌組織ATP含量和血漿FFA、E、NE濃度比較 與對照組相比，一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組心肌ATP含量均降低，血漿FFA含量、E濃度、NE濃度均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。一次力竭+倍他樂克治療組心肌ATP含量高于一次力竭組，血漿FFA含量、E濃度、NE濃度均低于一次力竭組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2大鼠心肌組織UCP2mRNA的表達測定 與對照組相比，一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組UCP2mRNA表達量均上調(diào)，分別增加64%、43%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。一次力竭+倍他樂克治療組UCP2mRNA表達較一次力竭組降低31%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）。

2.3大鼠心肌組織UCP2蛋白的表達測定 一次力竭組、一次力竭+倍他樂克治療組UCP2蛋白表達量較對照組表達量分別增加約78%、42%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。一次力竭+倍他樂克治療組UCP2表達較一次力竭組降低26%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2、圖3）。

2.4Pearson相關(guān)性分析 心肌組織ATP含量與UCP2表達量呈顯著負相關(guān)（r=-0.78，P ＜0.01）（圖4A）。血漿FFA濃度與血漿E、NE水平呈顯著正相關(guān)（r=0.92和r=0.86，P均＜0.01）（圖4B、圖4C）。心肌組織UCP2表達量與血漿FFA濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.814，P ＜0.01）（圖4D）。

表1　各組心肌ATP含量及血漿FFA、E、NE濃度比較（±s）

表1　各組心肌ATP含量及血漿FFA、E、NE濃度比較（±s）

注：ATP：三磷酸腺苷；FFA：游離脂肪酸；E：腎上腺素；NE：去甲腎上腺素；與對照組相比，aP＜0.05；與一次力竭組相比，bP＜0.05

分組　ATP含量（ng/mL）　FFA含量（mmol/L）　E濃度（ng/L）　NE濃度（ng/L）對照組　14.54±0.11　0.13±0.06　58.56±1.78　73.46±0.66一次力竭組　9.45±0.91a　0.43±0.10a　119.07±4.72a　123.30±3.09a一次力竭+倍他樂克治療組　11.01±0.46ab　0.29±0.03ab　105.74±2.84ab　118.83±2.53ab

3 討論

機體在劇烈運動等應(yīng)激刺激下，交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)活性增強，血中兒茶酚胺類物質(zhì)含量迅速上升，心肌代謝水平增強，耗氧量增加，當(dāng)最大攝氧量保持不變時，無論運動強度的大小，血漿去甲腎上腺素濃度都會不斷增加，直至力竭狀態(tài)［3，4］。本實驗也證實，當(dāng)大鼠運動達力竭狀態(tài)后血漿中腎上腺素和去甲腎上腺素濃度較對照組明顯升高，相關(guān)分析顯示，血漿FFA濃度與血漿E、NE水平呈顯著正相關(guān)，提示當(dāng)血漿兒茶酚胺類濃度增加時可加速脂肪分解，兒茶酚胺類與其受體（主要是β1、β3受體）結(jié)合后，通過G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）途徑使環(huán)-磷酸腺苷（cyclic adenosine monophate，cAMP）水平增高并激活蛋白激酶A（PKA）加速脂肪水解，使胞漿中FFA濃度增加。

心肌收縮時肌絲的滑動和Ca2+的轉(zhuǎn)運都需要ATP不斷水解提供能量，故當(dāng)能量代謝發(fā)生障礙時，心肌舒縮功能亦受影響。李楠等［5］研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭（心衰）時大鼠心肌UCP2表達增加，且隨UCP2的增加線粒體ATP合成減少，表明心衰時的能量代謝障礙與UCP2表達增加有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過游泳運動達力竭狀態(tài)的大鼠心肌組織UCP2mRNA和UCP2蛋白含量均增加，ATP含量明顯下降，ATP的下降程度與UCP2的增高程度顯著相關(guān)。雖然UCP2表達增加使氧化磷酸化過程脫偶聯(lián)，呼吸鏈電子回漏減少，活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成減少，對組織細胞的應(yīng)激損傷減少［6］，但UCP2的不適當(dāng)增加會進一步加重線粒體能量代謝紊亂，影響心肌正常舒縮功能，反而加重心肌損傷。相關(guān)分析提示UCP2表達的增加與血漿FFA增高呈顯著正相關(guān)，血漿FFA水平增高會誘導(dǎo)心肌組織UCP2表達上調(diào)，Murray等［7］經(jīng)實驗證實，F(xiàn)FA是通過過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferatoractivited receptors，PPARs）誘導(dǎo)UCP2基因表達的，其作用途徑可能是通過ROS介導(dǎo)的，PPARα能增加線粒體β-氧化，從而ROS的產(chǎn)生增多，導(dǎo)致UCP2mRNA上調(diào)。對UCP2的啟動子研究表明，UCP2啟動子區(qū)域包含ROS敏感性作用因子（AP-1和C/EBP）［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用β1受體阻滯劑美托洛爾后進行力竭運動的大鼠心肌組織UCP2mRNA和UCP2蛋白表達均較未用藥組下調(diào)，血漿FFA濃度、NE、E濃度均較未用藥組降低，而心肌ATP含量較未用藥組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示應(yīng)用β1受體阻滯劑后可通過減弱交感神經(jīng)緊張性，降低兒茶酚胺類濃度，減少血漿FFA生成，降低心肌UCP2的表達，提高ATP儲量，降低氧化應(yīng)激對心肌的損傷。美托洛爾是一種選擇性β1受體阻滯劑，能增加中樞神經(jīng)和心臟傳出迷走神經(jīng)的張力，通過減慢心率、降低心臟負荷及心肌收縮力，減少心肌細胞耗氧量［9］。Leenhardt等［10］研究證實，β1受體阻滯劑能有效阻斷腎上腺素能受體，使交感神經(jīng)興奮性減弱，兒茶酚胺類分泌減少，提高應(yīng)激、緊張或運動所誘發(fā)的室顫閾值，降低心率、減少室顫、穩(wěn)定心電活動，減少由交感活性增強引起的運動性猝死的發(fā)生。本實驗結(jié)果與Leenhardt研究結(jié)果相符，故推斷應(yīng)用β1受體阻滯劑后能改善心肌能量代謝障礙，可能會降低運動中惡性心臟性事件的風(fēng)險，對心源性猝死的預(yù)防有一定積極作用。

圖1　各組線粒體UCP2mRNA的表達量比較

圖2　各組心肌線粒體UCP2蛋白表達檢測

圖3　各組心肌線粒體UCP2蛋白表達的比較

圖4　A 心肌組織UCP2蛋白表達量與ATP含量的散點圖

圖4　B 血漿E濃度與FFA含量的散點圖

圖4　C 血漿NE濃度與FFA含量的散點圖

圖4　D 血漿FFA與心肌組織UCP2蛋白表達量的散點圖

體力活動可降低動脈粥樣硬化性心血管病的風(fēng)險，減少心血管疾病死亡率［11］，但劇烈的體力活動能增加心臟性事件的風(fēng)險，包括心源性猝死（SCD）［12］和急性心肌梗死（AMI）［13］。運動性猝死常見的心源性原因包括：肥厚型心肌?。℉CM）、致心律失常性右室心肌?。ˋRVC）、長QT間期綜合征（LQTS）、先天性冠狀動脈畸形、馬凡綜合征、心臟震蕩［14］。據(jù)統(tǒng)計，在＜35歲的年輕運動員中HCM是發(fā)生運動性猝死的最常見原因，約占運動員猝死的36%［15］，其特征性改變是左室壁不均一肥厚和心肌節(jié)段間厚度移行差異顯著。運動訓(xùn)練往往是長時間的體力和心理應(yīng)激，運動時引起血漿兒茶酚胺類濃度增加的部分原因是運動焦慮造成交感腎上腺系統(tǒng)活動增強引起的，且和運動者主體的心理特征密切相關(guān)［16］。β1受體阻滯劑能夠弛緩肥厚的心肌，降低心率及降低心肌細胞耗氧量，能減弱心理負荷有關(guān)的兒茶酚胺的作用，且在應(yīng)激狀態(tài)下不會妨礙正常的生理性血管擴張，推測在運動前給予β1受體阻滯劑可能會減少SCD的發(fā)生。

綜上所述，結(jié)合本研究及以往研究發(fā)現(xiàn)，機體在急性超負荷運動后血漿E、NE濃度持續(xù)增加，加速脂肪分解，使血漿FFA升高，通過ROS介導(dǎo)使心肌UCP2表達上調(diào)，ATP合成減少，能量代謝障礙。在應(yīng)用β1受體阻滯劑后可降低上述運動應(yīng)激對心肌能量代謝的不利影響，減輕心臟負荷，推斷其可能會減少運動訓(xùn)練中SCD的發(fā)生。

［1］ M Aron BJ，Shiran J，Poliac LC，et al. Sudden death in young competitive athletes:clinical， demographic，and pathological profiles［J］. JAMA，1996，276（3）:199-204.

［2］ Thomas DP，Marshall KI. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures［J］. Int J Sports Med，1988，9（4）:257-60.

［3］ Zouhal H，Jacob C，Delamarche P，et al. Catecholamines and the effects of exercise， training and gender［J］. Sports Medicine，2008，38（5）: 401-23.

［4］ Blegen M，Cheatham C，Caine-Bish N，et al. The immunological and metabolic responses to exercise of varying intensities in normoxic and hypoxic environments［J］. J Strength Cond Res，2008，22（5）:1638-44.

［5］ 李楠，王江，高峰，等. 壓力超負荷致心力衰竭大鼠解偶聯(lián)蛋白2表達及心肌能量變化［J］. 中華心血管病雜志，2009，37（12）:1108-12.

［6］ Hoss SE，Bahr GM，Echtay KS，et al. Lopimune-induced mitochondrial toxicity is attenuated by increased uncoupling protein-2 level in treated mouse hepatocytes［J］. Biochem J，2015，468（3）:401-7.

［7］ Murray AJ，Panagia M，Hauton D，et al. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor in the control of myocardial uncoupling protein levels［J］. Diabetes，2005，54（12）: 3496-502.

［8］ Cortez-Pinto H，Yang SQ，Lin HZ，et al. Bacterial lipopolysaccharide induces uncoupling protein-2 expression in hepatocytes by a tumor necrosis factor-α-dependent mechanism［J］. Biochemical and biophysical research communications，1998，251（1）:313-9.

［9］ β腎上腺素能受體阻滯劑在心血管疾病應(yīng)用專家共識［J］. 中華心血管病雜志，2009，37（3）:195-209.

［10］ Leenhardt A，Lucet V，Denjoy I，et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children A 7-year follow-up of 21 patients ［J］. Circulation，1995，91（5）:1512-19.

［11］ Thompson PD，Buchner D，Pi?a IL，et al. Exercise and physical activity in the prevention and treatment of atherosclerotic cardiovascular disease a statement from the Council on Clinical Cardiology （Subcommittee on Exercise， Rehabilitation， and Prevention）and the Council on Nutrition， Physical Activity， and Metabolism （Subcommittee on Physical Activity）［J］. Circulation，2003，107（24）: 3109-16.

［12］ Grabs V，Peres T，Zelger O，et al. Decreased prevalence of cardiac arrhythmias during and after vigorous and prolonged exercise in healthy male marathon runners［J］. Am Heart J，2015，170（1）:149-55.

［13］ Rai M，Thompson PD. The definition of exertion-related cardiac events［J］. British journal of sports medicine， 2011，45（2）:130-1.

［14］ 任明，柳茵. 心電圖在運動員猝死中的防治價值. 中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2012，4（1）:82-4.

［15］ 楊菊賢，卓楊. 運動員猝死的發(fā)生和預(yù)防［J］. 心血管病學(xué)進展，2007， 28（1）: 29-33.

［16］ Flaa A，Mundal HH，Eide I，et al. Sympathetic activity and cardiovascular risk factors in young men in the low， normal， and high blood pressure ranges［J］. Hypertension， 2006，47（3）:396-402.

本文編輯：阮燕萍

Influence of β1 receptor blocker on changes of myocardial energy metabolism and mechanism in ratsafter exhaustive exercise

JI Li-li*， LI Xiao-yan， MENG Ke， ZHANG Guo-ming， ZHANG Hong-ming， CHEN Ying-jian.*Liaoning Medical University Postgraduate Training Base of General Hospital of Chinese PLA Jinan Military Area Command， Jinan 250031， China.

LI Xiao-yan， E-mail: lixiaoyan902006@126.com

Objective To discuss the influence of β1receptor blocker on changes of myocardial energy metabolism and protective mechanism to stress myocardium in rats after exhaustive exercise. Methods Male Wistarrats （n=36） were randomly divided into control group， once exhaustion group and once exhaustion+metoprolol group （treatment group， each n=12）. The concentrations of myocardial ATP， plasma epinephrine （E）， norepinephrine （NE）and free fatty acid （FFA） were detected after exhaustive swimming. The expression of myocardial mitochondrial uncoupling protein 2 （UCP2） was analyzed by using RT-PCR and Western blot. Results Compared with control group， the concentrations of plasma FFA， E and NE increased and myocardial ATP decreased in once exhaustion group and treatment group （P＜0.05）. The results of RT-PCR showed that the expression of UCP2 mRNA increased by 64% in once exhaustion group and by 43% in treatment group compared with control group （all P＜0.05）. The results of Western blot showed that UCP2 expression increased by 78% in once exhaustion group and by 42% in treatment group compared with control group （all P＜0.05）. Correlation analysis showed that concentration of plasma FFA was positively correlated to levels of plasma E and NE （r=0.93， r=0.88， P＜0.01）， and UCP2 expression was greatly positively correlated to concentration of plasma FFA （r=0.98， P＜0.01）. Conclusion The application of β1receptor blocker can reduce adverse impact of exercise stress on myocardial energy metabolism， and relieve cardiac overload.

Uncoupling protein 2； Sudden cardiac death； β1receptor blocker； Free fatty acid； Rats

李曉燕，E-mail:lixiaoyan902006@126.com

R541

A

1674-4055（2016）01-0033-05

2014全軍后勤科研計劃項目（AWS13C008）
1250031 濟南，遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院濟南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2250031 濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科；3250031

濟南，南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.01.08