李紅梅，王顯

脂多糖對體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長的影響
——對建立支架內(nèi)再狹窄炎癥細(xì)胞模型的探索

李紅梅1，2，王顯1，2

目的 探討不同濃度脂多糖（LPS）作用不同時(shí)間對體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）生長的影響，分析其應(yīng)用于HCASMC的無毒性反應(yīng)濃度范圍，為開展介入術(shù)后再狹窄相關(guān)研究建立HCASMC炎癥活化模型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。方法 體外培養(yǎng)的HCASMC 3～5代，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用噻唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)（MTT法）檢測不同濃度（0 μg/ml，0.01 μg/ml，0.1 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，100 μg/ml）LPS在不同作用時(shí)間（24 h，46 h，72 h）下對HCASMC活力影響，酶標(biāo)儀492 nm處測定各組A值，細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值）/對照組A值。結(jié)果 LPS在低于100 μg/ml濃度范圍內(nèi)，干預(yù)HCASMC時(shí)間短于48 h未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，多表現(xiàn)為促細(xì)胞增殖效應(yīng)，而干預(yù)時(shí)間大于48 h則顯現(xiàn)出較為明顯的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞活力隨LPS濃度的增大而減低；干預(yù)72 h后LPS濃度在0～0.01μg/ml范圍內(nèi)有促增殖作用，0.1～0.5μg/ml濃度則產(chǎn)生輕微的細(xì)胞抑制作用，但細(xì)胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應(yīng)逐漸出現(xiàn)，且HCASMC活力隨LPS濃度的升高而減低。同一濃度水平的LPS隨著作用時(shí)間延長，HCASMC的細(xì)胞活力逐步下降，且作用時(shí)間越長下降越明顯。結(jié)論LPS在濃度0.1 μg/ml以下未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，其中LPS濃度0.01 μg/ml干預(yù)24 h，人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖最顯著，可作為建立炎癥誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞活化模型的最佳條件。

脂多糖；人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞活力；細(xì)胞毒性

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病治療史上的一大突破，然而介入術(shù)后3個(gè)月內(nèi)仍有10%～20%的再狹窄率，部分甚至并未降低主要不良心血管事件的發(fā)生［1，2］。目前國內(nèi)外十分關(guān)注支架內(nèi)再狹窄和支架血栓與炎癥因子之間的密切關(guān)系，公認(rèn)血管內(nèi)膜增生是動(dòng)脈血管對各種損傷的一種反應(yīng)，也是PCI術(shù)后再狹窄的重要標(biāo)志［3，4］。人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）被各種損傷刺激激活后，由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋潮硇筒⒁菩械絻?nèi)膜下，參與合成各種細(xì)胞外基質(zhì)，在內(nèi)膜增生過程中具有重要作用。越來越多的證據(jù)表明各種組織損傷能夠通過誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈壁的炎癥，進(jìn)而激活HCASMC加劇血管內(nèi)膜增生。炎癥誘導(dǎo)活化的HCASMC在介入術(shù)后再狹窄形成中起關(guān)鍵作用，針對HCASMC進(jìn)行炎癥相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究成為明確再狹窄核心機(jī)制的切入點(diǎn)。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也被稱為內(nèi)毒素，是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成成分之一，作為具有高度保守結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中充當(dāng)Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子配體，可刺激HCASMC分泌多種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，適合用于炎癥狀態(tài)下HCASMC功能的研究。由于建立HCASMC炎癥狀態(tài)下活化模型是再狹窄機(jī)制研究的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度LPS作用不同時(shí)間于體外培養(yǎng)的HCASMC，觀察不同條件下LPS對體外培養(yǎng)的HCASMC生長和增殖的影響，探索建立炎癥刺激HCASMC活化模型的LPS最佳濃度和作用時(shí)間，以期為利用LPS研究HCASMC炎癥增殖所致介入術(shù)后再狹窄機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1主要材料

1.1.1試劑 HCASMC（貨號：FC-0031）、平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國Life line公司；磷酸鹽緩沖液、噻唑蘭（MTT）粉末250 mg、二甲基亞礬（DMSO）瓶裝100 ml，均購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖10 mg/ml（貨號：L8880-10），購自Sigma （L2880）。

1.1.2儀器 超凈工作臺CJT-E-Ⅱ（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機(jī)LD4-2（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）、培養(yǎng)箱MCO-20AIC（SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Clinicbio 128C）、十萬分之一精密電子分析天平（日本島津AEC-45SM）。

1.2方法

1.2.1人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將保存于液氮罐中的細(xì)胞取出后立刻放到干冰上，將管子浸入37℃水浴中，待細(xì)胞懸液融化后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，并放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。之后2～3 d傳代一次，實(shí)驗(yàn)選用3～5代細(xì)胞。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對照孔（5個(gè)復(fù)孔）、LPS孔（每組6個(gè)復(fù)孔）。調(diào)零孔不加細(xì)胞，對照孔加細(xì)胞但培養(yǎng)基不加LPS，LPS孔加細(xì)胞和溶解有不同濃度LPS的培養(yǎng)基（0.01 μg/ml組，0.1 μg/ml組，0.5 μg/ml組，1 μg/ml組，5 μg/ml組，10 μg/ml組和100 μg/ml組）。

1.2.3接種細(xì)胞 當(dāng)細(xì)胞數(shù)占整個(gè)瓶底70%～80%時(shí)，將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為8×104個(gè)/mL，接種于三塊96孔板（調(diào)零孔加100μl無細(xì)胞培養(yǎng)基），100μl/孔，邊緣孔加入150μl PBS液填充，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日加不同濃度LPS。

1.2.4LPS干預(yù)措施 加LPS 次日取出三塊96孔板以無菌PBS沖洗2遍，調(diào)零孔和對照組每孔加入100μl正常培養(yǎng)基，LPS組每孔加入對應(yīng)等體積濃度的LPS溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。其中96孔板一用LPS刺激24 h，96孔板二用LPS刺激48 h，96孔板三用LPS刺激72 h。

1.2.5檢測細(xì)胞抑制率 96孔板達(dá)到各自LPS刺激時(shí)間后每孔加入20μl 0.5 mg/ml的對應(yīng)MTT培養(yǎng)基溶液，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加150μl DMSO振蕩10 min，待結(jié)晶全部溶解后于酶標(biāo)儀492 nm處測各孔A值，并計(jì)算不同濃度LPS刺激不同時(shí)間對HCASMC生長的影響。細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值）/對照組A值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 通過倒置相差顯微鏡觀察，剛復(fù)蘇的HCASMC漂浮于培養(yǎng)基中呈未貼壁狀態(tài)，細(xì)胞縮為圓形，單個(gè)或成團(tuán)存在，體積較小。培養(yǎng)6 h后大部分細(xì)胞貼壁，24 h后細(xì)胞貼壁完全。貼壁的HCASMC變?yōu)樗笮紊L，伸展性好，透明度好，3 d后進(jìn)入對數(shù)生長期并相互重疊生長，呈致密束狀排列（圖1，圖2）。

2.2不同濃度LPS作用24 h對HCASMC生長及增殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，剛種入96孔板的HCASMC體積較小，為圓形，非貼壁漂浮于培養(yǎng)基中，2 h后逐漸貼壁變?yōu)樗笮紊L，加入不同濃度LPS前各孔細(xì)胞已進(jìn)入對數(shù)生長期并鋪滿孔底80%。不同濃度LPS作用24 h后均對HCASMC產(chǎn)生促增殖作用，各LPS孔細(xì)胞數(shù)量增多，密度較對照組偏大。

圖1　倒置相差顯微鏡下HCASMC （40×）

圖2　倒置相差顯微鏡下HCASMC （100×）

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比，低中濃度（0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml及5 μg/ml）LPS對HCASMC有明顯促增殖作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。各濃度LPS都能增強(qiáng)細(xì)胞活力，其中0.01 μg/ml組LPS促增殖能力最明顯，細(xì)胞活力最強(qiáng)。但各組促增殖作用并未體現(xiàn)出濃度依賴性（表1，圖3）。

表1　不同濃度LPS作用24 h對HCASMC生長的影響

圖3　不同濃度LPS作用不同時(shí)間對HCASMC生長的影響

2.3不同濃度LPS作用48 h對HCASMC生長及增殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，加入不同濃度LPS前各孔細(xì)胞已進(jìn)入對數(shù)生長期并鋪滿孔底80%。不同濃度LPS作用48 h后均對HCASMC產(chǎn)生促增殖作用，各LPS孔細(xì)胞數(shù)量增多，密度增大，與作用24 h相比促細(xì)胞增殖能力稍有下降。

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比，不同濃度LPS對HCASMC增殖無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。但不同濃度LPS都對HCASMC活力有增強(qiáng)作用，其中0.01 μg/ml濃度的LPS促增殖能力最強(qiáng)。LPS孵育48 h促增殖作用無濃度依賴性（表2，圖3）。

2.4不同濃度LPS作用72h對HCASMC生長及增

殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，0.01μg/ml組 LPS作用72 h后HCASMC細(xì)胞數(shù)量增多，密度較對照組偏大，1～100μg/ml濃度組各孔細(xì)胞縮小變圓，部分細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞透明度降低，舒縮性較差，其余LPS濃度孔細(xì)胞與對照組相比未見顯著改變。

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比，100μg/ml 組LPS作用72 h后對HCASMC增殖的抑制作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），顯現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。LPS濃度在0～0.01 μg/ml范圍內(nèi)有促增殖作用，0.1～0.5 μg/ml濃度產(chǎn)生輕微的細(xì)胞抑制作用，但細(xì)胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應(yīng)逐漸出現(xiàn)，且HCASMC活力隨LPS濃度的升高而減低（表3，圖3）。

2.5不同濃度LPS不同作用時(shí)間對HCASMC細(xì)胞活力的影響對比 各濃度組作用24 h后細(xì)胞活力升高，作用48 h后輕度升高，而作用72 h后細(xì)胞活力下降。同一濃度水平的LPS隨著作用時(shí)間延長，HCASMC的細(xì)胞活力逐步下降，且作用時(shí)間越長下降越明顯（表4，圖4）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病引發(fā)的急性心血管事件是嚴(yán)重危害人類生命健康的頭號殺手，經(jīng)導(dǎo)管支架植入術(shù)成為目前治療的有效途徑，然而支架術(shù)后有10%～20%再狹窄率以及延遲性支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)成為介入領(lǐng)域廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。通常認(rèn)為，支架內(nèi)再狹窄是局部血管對損傷的一種反應(yīng)，支架術(shù)后血管重塑與炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡、內(nèi)皮功能損害、血栓形成等密切相關(guān)［5］，血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移是常見血管病變的共同病理基礎(chǔ)［6，7］。研究表明，在炎癥細(xì)胞浸潤和血小板聚集的共同作用下，大量細(xì)胞因子和生長因子釋放，激活血管中層平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚和管腔狹窄［8-10］。

表2　不同濃度LPS作用48h對HCASMC生長的影響

表3　不同濃度LPS作用72h對HCASMC生長的影響

表4　不同濃度LPS作用不同時(shí)間對HCASMC細(xì)胞活力的影響

圖4　不同濃度LPS作用不同時(shí)間對HCASMC活力的影響

模式識別受體是一種經(jīng)過廣泛選擇的種系編碼受體，它們通過分子模式來感知侵入機(jī)體的危險(xiǎn)信號，與其它免疫組分一起構(gòu)成了機(jī)體的第一道防線［11，12］，其中Toll樣受體（toll 1ike receptors，TLRs）是研究較多的參與炎癥反應(yīng)且與先天免疫有關(guān)的模式識別受體家族。TLRs（包括TLR2和TLR4）能識別病原體，在病原體入侵機(jī)體的早期即可啟動(dòng)先天免疫，TLR4介導(dǎo)的髓樣分化蛋白MyD88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗感染中發(fā)揮重要作用［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能識別組織細(xì)胞損傷后釋放的內(nèi)源性配基和一些危險(xiǎn)信號，從而介導(dǎo)炎癥性反應(yīng)和細(xì)胞增殖與分化等［4，12］。TLR4被激活后引起自身的二聚化與MyD88結(jié)合，MyD88通過其死域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）結(jié)合，導(dǎo)致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），促使有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族活化，其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）誘導(dǎo)激酶激活I(lǐng)-κB家族α、β激酶，導(dǎo)致I-κB磷酸化而降解，使NF-κB移位到細(xì)胞核，啟動(dòng)TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，這些炎癥介質(zhì)參與血管損傷反應(yīng)，在HCASMC增殖、分化和凋亡的過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用［12-14］。由此可見，成功建立TLRs-MyD88炎癥激活狀態(tài)下的HCASMC模型作為支架內(nèi)再狹窄的研究載體將成為下一步研究的核心所在，而LPS作為TLRs-MyD88炎癥信號通路的直接激活劑，成為本實(shí)驗(yàn)干預(yù)研究的主要制劑。

LPS是炎癥相關(guān)研究的常用藥物。體外培養(yǎng)的HCASMC識別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS并釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。Toll-4受體作為LPS的主要受體，參與LPS信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號蛋白及下游轉(zhuǎn)錄因子在數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生改變，可引起炎癥因子釋放、抗炎因子產(chǎn)生減少，并導(dǎo)致特定信號通路的激活［15］，因此合理應(yīng)用這一藥物是后續(xù)建立HCASMC炎癥細(xì)胞模型成敗的關(guān)鍵。

MTT法［16-18］是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。因本方法具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)，故本研究選擇MTT法作為檢測LPS刺激細(xì)胞生長增殖情況的基本方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS不同濃度和不同作用時(shí)間對體外培養(yǎng)的HCASMC細(xì)胞生長有著直接影響。LPS＜100μg/ml時(shí)，干預(yù)HCASMC時(shí)間小于48 h未出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性，而干預(yù)時(shí)間大于48 h則顯現(xiàn)出較為明顯的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞活力隨LPS濃度的增大而減低；干預(yù)72 h后LPS濃度在0～0.01 μg/ml范圍內(nèi)有促增殖作用，0.01～1 μg/ml濃度產(chǎn)生輕微的細(xì)胞抑制作用，但細(xì)胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應(yīng)逐漸出現(xiàn)。同一濃度水平的LPS作用下則隨著時(shí)間延長，HCASMC的細(xì)胞活力逐步下降，且作用時(shí)間越長下降越明顯。

由此可以推測，LPS在濃度1 μg/ml以下不會(huì)引起細(xì)胞毒性，0.01 μg/ml干預(yù)24 h條件下可最大程度刺激HCASMC增殖，可作為建立炎癥誘導(dǎo)HCASMC活化模型的最佳條件。但本研究也存在一些不足，首先本研究是基于離體水平的實(shí)驗(yàn)探索，在體水平的研究有待進(jìn)一步完善。其次，本研究只初步觀察了LPS對HCASMC生長增殖的影響，摸索出的條件僅能夠簡單反映炎癥條件下的HCASMC增殖狀態(tài)，然而此條件下能否同時(shí)對細(xì)胞內(nèi)TLRs-MyD88炎癥信號通路產(chǎn)生最大程度的激活作用還需完善后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)和摸索。

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本文編輯：姚雪莉

Influence of lipopolysaccharide on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells: an investigation on establishing in-stent restenosis inflammatory cell model

LI Hong-Mei*， WANG Xian.*Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China.

WANG Xian， E-mail: wx650515@163.com

Objective To investigate the influence of lipopolysaccharide （LPS） in different doses on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells （HCASMC） at different times， analyze non-toxic concentration range of LPS to HCASMC， and provide test data for establishing HCASMC inflammation activation model in studies related to restenosis after interventional therapy. Methods HCASMC was cultured in vitro for 3-5 generations， and seeded onto 96-well plates. The influences of LPS in different doses （0 μg/mL， 0.01 μg/mL， 0.1 μg/mL， 0.5 μg/ mL， 1 μg/mL， 5 μg/mL， 10 μg/mL and 100 μg/mL） on viability of HCASMC at different time points （24 h，46 h，72 h） were detected by using MTT assay. The value A was detected by using ELISA at point of 492 nm， and cell viability=（value A of test group- value A of zero hole）/value A of control group. Results When LPS dose was lower than 100 μg/mL and interventional time was shorter than 48 h， there was no cytotoxicity observed to HCASMC and there was promotion effect on proliferation. When interventional time was longer than 48 h， there was significant cytotoxicity observed and viability of HCASMC would decrease as LPS dose increased. After intervention for 72 h，LPS had promotion effect on proliferation in doses from 0 μg/mL to 0.01 μg/mL， and mild inhibitory effect in doses from 0.1 μg/mL to 0.5 μg/mL but cytotoxicity was not significant. The toxic reaction gradually appeared when LPS dose was from 1 μg/mL to 100 μg/mL， and viability of HCASMC decreased as LPS dose increased. When LPS doses were the same， viability of HCASMC gradually decreased as interventional time was prolonged， and the longer the interventional time was， the more significant the decrease of HCASMC was. Conclusion LPS had no significant cytotoxicity when its dose is 0.1 μg/mL， and when its dose is 0.01 μg/mL， the proliferation of HCASMC will be more significant after intervention for 24 h， which can be taken as the best condition for establishing HCASMC inflammation activation model.

Lipopolysaccharide； Human coronary artery smooth muscle cells； Cell viability； Cytotoxicity

R543.3

A

1674-4055（2016）01-0029-05

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273913）；北京中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放課題（2013-ZDXKKF-27）
1100700 北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院；2100700北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.01.07

王顯，E-mail:wx650515@163.com