劉秀花　梁　梁　陳仲達　張淑紅　宋兆齊　王　莉　梁　峰（商丘師范學院　生物精煉河南省工程實驗室，河南　商丘　476000）

?

小球藻等離子束誘變高產(chǎn)菌篩選

劉秀花梁梁陳仲達張淑紅宋兆齊王莉梁峰
（商丘師范學院生物精煉河南省工程實驗室，河南商丘476000）

采用等離子束誘變對小球藻進行誘變處理，以期提高細胞油脂含量。通過熒光分光光度法對誘變菌株進行初篩，其中6株菌油脂含量高于出發(fā)菌株。再通過蘇丹黑染色觀察、尼羅紅染色和酸熱解法提取油脂等進行復篩，其中45s2-14產(chǎn)油量最高，達到0.070 7g/mL，45s2-1單位鮮菌體產(chǎn)油量達到26.9%，進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件將有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

小球藻；等離子束誘變；油脂

隨著化石能源的日漸枯竭，以及化石能源所帶來的溫室效應(yīng)日漸嚴重，越來越多的科研工作者開始投入到可再生能源的研究和開發(fā)利用上［1］。無論是作為保健品或者是制備生物柴油，油脂都起到重要的作用。以動物、高等植物為原材料的油脂已經(jīng)不能夠滿足人們?nèi)粘Ｉ詈凸I(yè)生產(chǎn)的需要［2］。而微藻類作為一種新型的化石能源替代品，由于其具有來源廣、成本低、清潔可再生、生長速度快［3］，光合作用效率高，不占用耕地面積［4］，易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，備受科研工作者的青睞［5］。微藻中得到的脂肪酸可轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯，即生物柴油。生物柴油作為化石能源的替代品，是一種新型可再生能源，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于成本較高等因素限制了微藻油脂制備的工業(yè)化生產(chǎn)［6］。目前，降低藻類油脂制備成本成為亟待解決的一大問題。降低成本的方法有很多，包括優(yōu)化培養(yǎng)基，降低培養(yǎng)成本，增加微藻油脂的積累量，增加可直接轉(zhuǎn)化為生物柴油的成分，簡化微藻生物柴油制備的生產(chǎn)工藝等。而增加微藻油脂積累的同時又提高微藻的生物量是最重要的方法，要大幅度提高油脂產(chǎn)量，選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的微生物菌種是最有效的途徑。

該研究從增加油脂的積累量著手，通過對小球藻進行等離子束誘變，并對誘變菌株進行初篩、復篩，得到2株高產(chǎn)微藻藻株，從而為進一步提高油脂含量，以及利用微藻大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)制備生物柴油進行有益探索。

1　材料與方法

1.1藻種和培養(yǎng)基

選用實驗室所分離純化并鑒定的小球藻（Chlorella sp.ZSLD-2-1 KF689557）。

培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BBM培養(yǎng)基，g/L）：NaNO30.25，KH2PO40.175，K2HPO40.075，MgSO40.075，CaCl2· 2H2O 0.025，NaCl 0.25，EDTA 0.05，KOH 0.031，F(xiàn)eSO4· 7H2O 4.98×10-3，MnCl21.44×10-3，H3BO311.42×10-3，Zn-SO48.82×10-3，MoO30.71×10-3，CuSO4·5H2O 1.57×10-3，CO（NO3）2·6H2O 0.49×10-3，瓊脂18g。培養(yǎng)基的配制方法：先量取500mL蒸餾水，加入1 000mL燒杯中，置于磁力攪拌器上，再依次加入上述試劑，定容至1 000mL，調(diào)pH至8.0。分裝于500mL三角瓶中。高壓蒸汽滅菌121℃滅菌30min，倒平板備用。

1.2研究方法

1.2.1等離子束誘變。采用北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司生產(chǎn)的MANDELA型多功能等離子體誘變系統(tǒng)誘變。從斜面培養(yǎng)基挑取目的菌株，平板劃線，放置于小球藻培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)6d。從培養(yǎng)6d后的平板上挑取菌種接種至無菌水中懸浮。用移液槍吸取1.5mL藻液，離心收集藻體。用生理鹽水重懸藻體，取1mL重懸后的藻液于血球計數(shù)板上，計數(shù)并調(diào)整藻液細胞數(shù)為105個/mL。取重懸后的藻液15μL，加入誘變系統(tǒng)的加樣器中制成菌膜。將加樣器放入誘變器中在通氣量為12SLM，高度為5mm的條件下設(shè)定誘變時間分別為0、30、40、45、50、55、60、70s和80s誘變。用移液槍吸取1.5mL生理鹽水沖洗菌膜，收集沖洗液，并吸取0.1mL沖洗液涂布平板，再用封口膜封閉平板，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2.2初篩。采用尼羅紅熒光分光光度法初篩。挑取死亡率在80%左右的誘變菌株進行初篩。將誘變菌株分別接種于含有50mL BBM液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)3d。3d后從每個錐形瓶內(nèi)吸取lmL菌液計數(shù)，保證最后接種量一致。分別等量接種在5mL BBM液體培養(yǎng)基的試管中，每個菌株接3管，置于培養(yǎng)室內(nèi)傾斜培養(yǎng)10d。將培養(yǎng)10d后的藻液離心收集菌種，離心收集后的藻種重懸浮于30mL離心管中。取8mL重懸后的菌液，加入2mL的二甲基亞楓，搖晃使之充分混勻。再加入30μL尼羅紅染液，放置10min，取適量染色后的菌液放置于熒光分光光度計中，測定吸收峰［7，8］。初篩結(jié)果以單位熒光強度數(shù)值大小判定。單位熒光強度=（吸收峰-基礎(chǔ)峰）/OD。

1.2.3復篩。將初篩所得目的菌株分別接種于100mL的BBM液體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)10d，之后分別用熱酸解法提取油脂，尼羅紅染色熒光顯微觀察，蘇丹黑染色顯微觀察的方法進行復篩。

酸熱解法提取油脂：取若干支恒重的離心管，將培養(yǎng)10d后的菌液離心（8 000r/min，5min）收集菌體。將離心管倒置控水1h后，稱取鮮菌體質(zhì)量。之后加入6mol/L的HCl 6mL，并放置于超聲波破碎儀中處理30min，再置于沸水浴中2h，使細胞完全破碎。取出并冰水浴10min，加入95%乙醇，放置10min。再加入5mL乙醚、5mL石油醚，搖晃使之混勻。離心（8 000r/min，5min），吸取上層有機溶劑層置于恒重的試管中。再在上述離心管中加入5mL乙醚、5mL石油醚，搖晃使之混勻。離心（8 000r/min，5min），吸取上層有機溶劑層置于稱過重的試管中。將含有有機溶劑的試管放置于通風櫥中冷卻，再置于烘箱中（40℃）使有機溶劑揮發(fā)，稱取油脂質(zhì)量［9］。

蘇丹黑染色方法：吸取1mL培養(yǎng)10d后的菌液，離心收集菌體（8 000r/min，3min），加入一定量的蘇丹黑染液，染色30～60min。將染色后的菌液離心棄上清，并加入一定量的無菌水，搖晃混勻后再次離心棄上清，之后加入70%乙醇，搖晃混勻，離心棄上清。最后加入一定量的無菌水，制片觀察［10］。

2　結(jié)果分析

2.1初篩結(jié)果

對誘變菌株進行初篩，最終得到6株含油量較高的菌株，分別為45s2-1、45s2-8、45s2-12、45s2-13、45s2-14 和L4，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，45s2-14的OD只值最高，表明菌體收獲量最多；而45s2-12的單位菌體熒光強度最高，為116.483；45s2-13稍次之，為91.005?？梢猿醪降贸鼋Y(jié)果，誘變后的菌株油脂含量有明顯提高。但由于尼羅紅染色熒光分光光度計只能粗略地估計藻類細胞內(nèi)的大致油脂含量，所以還需進一步開展研究實驗進行驗證。

表1　初篩結(jié)果

2.2復篩結(jié)果

通過對初篩結(jié)果采用尼羅紅染色、蘇丹黑染色顯微觀察及酸熱解法提取油脂等方法進行分析，尼羅紅染色結(jié)果見圖1，蘇丹黑染色結(jié)果見圖2，結(jié)果表明尼羅紅染色與蘇丹黑染色結(jié)果一致，誘變后細胞內(nèi)油脂含量明顯增加。

圖1　尼羅紅染色熒光顯微圖像

圖2　蘇丹黑染色顯微圖像

為了解藻體細胞的含油量，采用了酸熱解法提取油脂，結(jié)果見表2。

表2　100mL藻體培養(yǎng)物產(chǎn)油脂能力

從表2可以看出，45s2-1的單位菌體含油百分比最高為26.9%，產(chǎn)油量達到0.698g/mL，而45s2-14產(chǎn)油量最大，達到0.070 7g/100mL藻液，單位菌體含油百分為23.2%。經(jīng)比較分析，可以看出，綜合生物量和產(chǎn)油量45s2-1含油量最高，不過由于菌體量最低，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。在以后的研究實踐中，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基等方法提高其菌體生長速率與菌體量。45s2-14雖然含油量不是最高，但鮮菌體重量與油脂含量都較高，適合作為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)菌株。

3　分析與討論

采用尼羅紅染色熒光分光光度計法初篩，45s2-12和45s2-13的單位菌體熒光強度值最大，遠高于出發(fā)菌株L4。復篩采用染色法和提取法，通過對菌株進行尼羅紅染色和蘇丹黑染色比較細胞內(nèi)油脂含量，又通過酸熱解法提取油脂，測定菌株實際含油量。得到準確的數(shù)據(jù)，確定高含油菌株。最后得出，45s2-1含油百分比最高，45s2-14次之。但由于相同培養(yǎng)條件下45s2-14鮮菌體量較高，且實際所得油脂量最大，適合于大規(guī)模的培養(yǎng)與油脂提取。45s2-1雖然含油百分比最高，但由于生長量較低，所以實際所得油脂量卻不是最高的。因此，在以后的實驗研究中，需對45s2-1菌株進行培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基的優(yōu)化，以提高45s2-1的生長量，得到更多的油脂。同時，在以后的科研工作中還可以通過運用基因工程、定點突變等技術(shù)手段對微藻進行改造，以便得到更高產(chǎn)油脂量的菌株。

通過等離子束誘變處理，對誘變菌株進行初篩得出6株高含油量菌株，又通過復篩，測定實際含油量，得出2株高含油量的目的菌株。從油脂含量方面入手，對未來的生物柴油的大規(guī)模生產(chǎn)得到較滿意的結(jié)果。但在未來的研究中，還需從優(yōu)化培養(yǎng)基、改變生長條件、改變其代謝方式、簡化生產(chǎn)工藝的多方面同時入手，不斷向生物柴油的大規(guī)模生產(chǎn)，造福于全人類的方向推進。同時，微藻作為一種營養(yǎng)豐富的高價值植物，無論是對其進行食品加工或是保健品的開發(fā)都具有廣闊的前景。

［1］王萌，陳章和.藻類生物柴油研究現(xiàn)狀與展望［J］.生命科學，2011（1）：121-126.

［2］宋東輝，侯李君，施定基.生物柴油原料資源高油脂微藻的開發(fā)利用［J］.生物工程學報，2008（3）：341-348.

［3］王蒙，李純厚，戴明.以海洋微藻為原料提取生物燃料的研究進展與發(fā)展趨勢［J］.南方水產(chǎn)，2009（1）：74-80.

［4］姜進舉，苗鳳萍，馮大偉，等.微藻生物柴油技術(shù)的研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國生物工程雜志，2010（2）：134-140.

［5］Chisiti Y.Biodiesel from microalgae beats bioethanol ［J］.Trends Biotechnol，2008（3）：126-131.

［6］Miao Xiaoling，Wu Qingyu.Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil［J］.Bioresource Technol，2006（6）：841-846.

［7］王海英，符茹，黃寶祥.基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測方法研究［J］.中國油脂，2012（3）：78-81.

［8］梁文艷，張元春，曹敬燦，等.采用尼羅紅熒光探針對微藻中油脂的定量測定［J］.環(huán)境化學，2013（8）：1491-1495.

［9］E.G.Bligh，W.J.Dyer.A rapid method of total lipid extraction and purification［J］.Canadian Journal of Biochemistry and Physiology，1959（8）：911-917.

［10］林汝榕，邢炳鵬，蔡文炫，等.蘇丹黑B染色處理細胞技術(shù)在快速檢測微藻油脂含量中的應(yīng)用［J］.臺灣海峽，2011（2）：292-298.

Screening High Oil Production Strains from Plasma-Beam Treated Mutagenic Chlorella

Liu XiuhuaLiang LiangChen ZhongdaZhang ShuhongSong ZhaoqiWang LiLiang Feng
（Biorefinery Engineering Lab of Henan Province，Shangqiu Normal University，Shangqiu Henan 476000）

High oil production strains were screened out from plasma-beam treated Mutagenic Chlorella，in order to improve the cellular lipid content.The screening of the mutant strain was carried out by means of fluorescence spectrophotometry，and the content of six strains of bacteria was higher than that of the starting strain.Then screening by Sultan black staining，Nile red staining and acid solution of heat extraction oil etc，45s2-14 has the highest oil content，which is 0.070 7g/mL，45s2-1 unit fresh biomass production reached 26.9%，further optimization of the culture conditions would be expected to be applied to industrial production.

Chlorella；plasma-beam mutagenesis；oil

TQ923

A

1003-5168（2016）04-0122-03

2016-03-06

河南省重點科技攻關(guān)項目資助（132102310039，142102310044）；河南省教育廳自然科學研究項目（13A180830）。

劉秀花（1963-），女，教授，研究方向：微生物資源、酶制劑、生物能源。