張桂前，高建梅，孫　鹥 綜述，段　勇 審校

(1.云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

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·綜述·

乙型肝炎基因分型的研究進(jìn)展*

張桂前1，高建梅1，孫鹥1綜述，段勇2△審校

(1.云南省第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

乙型肝炎；基因分型；乙型肝炎病毒

乙型肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝)病毒(HBV)感染是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球約20億人感染過(guò)HBV，其中3.5億人成為了慢性HBV感染者[1]，約15%～40%的HBV感染者最終發(fā)展成為了肝硬化或肝癌[2]，全球每年約100萬(wàn)人死于乙肝所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。HBV的感染呈地方性流行，超過(guò)75%的HBV感染者分布于西太平洋地區(qū)和東南亞國(guó)家，乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率在西歐、北美僅0.1%～0.9%，而在亞洲國(guó)家高達(dá)5%～10%。中國(guó)累計(jì)有7億人曾感染過(guò)HBV，有1.2億人成為了病毒攜帶者，每年約60萬(wàn)人死于HBV感染引起的相關(guān)疾病。HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸不僅與患者年齡和免疫力有關(guān)，而且也與病毒株的基因型密切相關(guān)，所以研究HBV基因型有重要的臨床意義。通過(guò)HBV基因分型，可以了解基因型的地區(qū)分布特點(diǎn)以及在人群中的變異和進(jìn)化趨勢(shì)。

1　概　述

HBV屬于嗜肝病毒的一種，核酸為部分共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA，其雙鏈長(zhǎng)度不同，與病毒mRNA互補(bǔ)全長(zhǎng)的一條鏈為負(fù)鏈，而另一條為正鏈，長(zhǎng)度不定，約為負(fù)鏈的50%～100%。病毒基因組長(zhǎng)度在3 182～3 221個(gè)核苷酸， 含4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框(ORF)，即前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。S-ORF分為前S1區(qū)、前S2區(qū)和S區(qū)，各有其起始密碼子ATG,編碼大、中、小3種包膜蛋白；C-ORF分為前C區(qū)和C基因區(qū)，各自有起始密碼ATG，編碼HBeAg及HBcAg，這一區(qū)段最保守，是免疫攻擊的靶表位所在；P-ORF 是最長(zhǎng)的閱讀框，與C-ORF、S-ORF、X-ORF重疊，編碼病毒聚合酶；X-ORF編碼HBx蛋白，HBx是一種多功能的反式調(diào)節(jié)因子，可反式激活增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能。在病毒基因組上，不僅有編碼蛋白的結(jié)構(gòu)基因，還有調(diào)節(jié)元件，包括4個(gè)啟動(dòng)子、2個(gè)增強(qiáng)子、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件、負(fù)調(diào)節(jié)元件、CCAAT元件等。由于HBV復(fù)制過(guò)程中需經(jīng)過(guò)RNA中間體的逆轉(zhuǎn)錄，而該逆轉(zhuǎn)錄酶又缺乏校正功能，所以HBV具有高變異性，其突變率約為(1.4～3.2)×10-5位點(diǎn)/年。因此，在生活環(huán)境和免疫壓力下，HBV不斷變異從而形成了不同的準(zhǔn)種、基因型和基因亞型。

2　乙型肝炎的基因分型和流行分布

由于全基因序列分析比較復(fù)雜，HBV舊的分型原則可根據(jù)部分基因特別是S基因序列進(jìn)行分型，因?yàn)镾基因的序列相對(duì)其他序列而言異質(zhì)性最小，也更加保守，從而根據(jù)S區(qū)基因序列的異質(zhì)性≥4%的標(biāo)準(zhǔn)代替全基因序列分型。但新近提出的分型原則認(rèn)為必須要以全基因組序列作為分型依據(jù)，并糾正了一些錯(cuò)誤分型。例如，Khedive等[3]對(duì)伊朗的HBV攜帶者681 bp的分離株進(jìn)行分析，報(bào)告了5株亞型(D5和D8)，這與已知的地理分布不一致；以及Shi等[4]對(duì)B3亞型的錯(cuò)誤分型等。目前HBV有8個(gè)證實(shí)基因型(A至H)和2個(gè)暫定基因型(I和J)[5]。其中，基因型A又進(jìn)一步分為A1～A7亞型；B型分為B1～B9亞型；C型有C1～C16亞型；D型有D1～D8亞型；基因型F只有4種亞型F1～F4；其他基因型目前還未發(fā)現(xiàn)亞型存在。

基因型分布在不同的地區(qū)和不同的人種中。有關(guān)HBV基因型研究表明，B和C基因型主要分布在亞洲，而歐洲最常見(jiàn)的基因型是A和D型[6]。地中海、中東、中亞地區(qū)以D型為主，北美地區(qū)C型為主，其次是A和B型，H型少量分布在美國(guó)中部。印度的基因型以D型為主，D型是全球分布最廣的基因型，E型是西非的優(yōu)勢(shì)亞型，F(xiàn)型是在南美洲和中美洲發(fā)現(xiàn)的。G型是目前HBV基因分型中最少見(jiàn)的一個(gè)型，它是2000年時(shí)由來(lái)自美國(guó)和法國(guó)的標(biāo)本中分離的。G型導(dǎo)致感染是通常要有其他型的HBV存在，最常見(jiàn)的就是G型合并A2型，因?yàn)锳2型能夠增強(qiáng)G型病毒的復(fù)制[7]。我國(guó)以B和C兩種基因型為主，也有少量的A和D基因型和B/C基因型混合感染，其中北方以C型為多，南方以B型占優(yōu)勢(shì)，各省之間并不完全相同[8]。越來(lái)越多的研究表明在不同的國(guó)家、地區(qū)和人群中流行的HBV存在基因型上的差異。見(jiàn)表1。

表1　HBV基因型的地理分布表[9-14]

3　HBV基因分型的方法

至今HBV基因分型的檢測(cè)方法主要包括以下 10 種[15-17]：

3.1全基因測(cè)序法全基因測(cè)序法是PCR擴(kuò)增HBV全基因DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后進(jìn)行測(cè)序并做種系進(jìn)化統(tǒng)計(jì)，分析不同病毒株之間的親緣關(guān)系，得出各病毒株的型別，該方法是分析和確定基因型的最準(zhǔn)確方法，也是 HBV 基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。但耗時(shí)、費(fèi)用高，不適用于大規(guī)模流行基因病學(xué)調(diào)查。

3.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP) 基因分型法PCR-RFLP基因分型法是先將待測(cè)的靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，再用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同基因型的序列產(chǎn)生的限制性片段數(shù)目和長(zhǎng)度不同，最后經(jīng)電泳分析靶DNA片段而分型。此法不需雜交和測(cè)序，是一種有效、簡(jiǎn)便的分型方法，適用于流行病學(xué)調(diào)查研究。缺點(diǎn)是：酶切位點(diǎn)易受基因變異的影響，且混合感染或酶切不完全時(shí)，會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜條帶，影響結(jié)果判斷。

3.3單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分型法單克隆抗體ELISA分型法是根據(jù)HBV前S2區(qū)的特異性表位設(shè)計(jì)特異的單克隆抗體，并用辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)志，一般采用雙抗體夾心法分析聯(lián)合檢測(cè)，可以得到各待測(cè)標(biāo)本的表位組合，這些表位與基因型存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)單克隆抗體表位鑒定出不同的基因型。該方法操作簡(jiǎn)便，可用于大樣本的檢測(cè)。但對(duì)一些混合型感染和HBsAg低水平表達(dá)的標(biāo)本可能無(wú)法鑒別。

3.4型特異性引物-PCR分型法型特異性引物-PCR分型法是對(duì)HBV各型別全序列或某目標(biāo)序列(S區(qū))進(jìn)行比對(duì)分析，找出每種基因型的獨(dú)特序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行兩次或一次PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后得到不同長(zhǎng)度的相應(yīng)基因產(chǎn)物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析確定不同的基因型。該方法簡(jiǎn)化了操作步驟，特異性較高，是目前應(yīng)用比較多的一種適合大樣本研究的方法，不足是存在非特異性擴(kuò)增。

3.5PCR 微板核酸雜交-ELISA法PCR微板核酸雜交-ELISA法是將基因擴(kuò)增、核酸分子雜交和酶聯(lián)免疫顯色3種技術(shù)融為一體，發(fā)揮了核酸分子雜交技術(shù)特異性高、PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏度高和酶聯(lián)顯色檢測(cè)方便的優(yōu)點(diǎn)。首先將待測(cè)核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物加入預(yù)先包被HBV通用探針的微孔板，再加入HBV各基因型顯色探針，進(jìn)行微板核酸雜交，然后通過(guò)酶聯(lián)免疫顯色判斷結(jié)果。該方法耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、且準(zhǔn)確可靠，可用于大規(guī)模的HBV分型檢測(cè)。

3.6線(xiàn)性探針?lè)治?LiPA)基因分型法LiPA基因分型法遵循反向雜交的原理，根據(jù)待測(cè)序列設(shè)計(jì)各型特異性線(xiàn)性探針并固化在支持物上，對(duì)待測(cè)標(biāo)本特定序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與固相探針?lè)聪螂s交，經(jīng)顯色反應(yīng)得出結(jié)果。該法最大優(yōu)點(diǎn)是可鑒別用直接測(cè)序不能區(qū)分的混合型感染。

3.7實(shí)時(shí)定量 PCR-溶解曲線(xiàn)分析實(shí)時(shí)定量PCR-溶解曲線(xiàn)分析是將傳統(tǒng)PCR檢測(cè)模式中的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)相結(jié)合，并用溶解曲線(xiàn)分析確定基因型，不同的基因型其目標(biāo)序列與探針結(jié)合時(shí)GC含量間的互補(bǔ)性差異導(dǎo)致不同的熔解溫度(TM)。該方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可鑒別混合型感染。

3.8限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性(RFMP)RFMP以限制性?xún)?nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生型特異性寡核苷酸片段，產(chǎn)生片段的分子量用質(zhì)譜進(jìn)行分析。該方法檢測(cè)限100 copy/mL,靈敏度較高，可以檢測(cè)突變型和野生型標(biāo)本，但儀器體積龐大，價(jià)格昂貴。

3.9多重PCR多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加入2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析確定其基因型。其經(jīng)濟(jì)、快速，可用于大規(guī)模研究，可檢測(cè)混合基因型，但單核苷酸多態(tài)性(SNP)酶切位點(diǎn)可影響到方法的靈敏度。

3.10PCR-侵入法PCR-侵入法能檢測(cè)不同的基因型和亞型，先用多重PCR擴(kuò)增S序列，然后經(jīng)過(guò)2個(gè)侵入反應(yīng)，第1個(gè)侵入反應(yīng)是將擴(kuò)增產(chǎn)物與型特異的寡核苷酸初級(jí)探針(P1或P2)結(jié)合，根據(jù)基因型對(duì)P1或P2的5′端進(jìn)行切割，導(dǎo)致5′翼片的釋放，在第2個(gè)反應(yīng)中，切割下來(lái)的5′翼片能和其通用的FRET盒結(jié)合，導(dǎo)致其切割并釋放特異性熒光，產(chǎn)生的熒光信號(hào)與HBV基因型相對(duì)應(yīng)。該方法有極高的靈敏度，可檢測(cè)混合基因型，同樣SNP酶切位點(diǎn)可影響到方法的靈敏度。

4　乙肝基因型的致病性和治療反應(yīng)

研究資料顯示，不同基因型/亞型其臨床表現(xiàn)不同。日本一項(xiàng)包括585例慢性乙肝患者的研究表明，基因型B較C型進(jìn)展至肝硬化更緩慢，更早發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換和有更少的炎癥活動(dòng)[18]；基因型C和D引起的肝臟疾病比基因型A和B更嚴(yán)重，轉(zhuǎn)化成肝癌的可能性更大。與基因型B相比，基因型C患者HBeAg陽(yáng)性和HBV DNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平、肝臟病理的炎癥和纖維化程度均較高；基因型C患者HBeAg更易在年齡偏大時(shí)發(fā)生血清轉(zhuǎn)換延遲，對(duì)干擾素的應(yīng)答率也較低。顧錫炳等[19]的研究認(rèn)為C基因型感染者非特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)比B基因型感染者高，非特異性細(xì)胞免疫清除HBV的作用相對(duì)較弱，在清除HBV的過(guò)程中可起肝細(xì)胞損傷。這可能是導(dǎo)致C基因型HBV DNA水平、HBeAg陽(yáng)性率、肝功能損害高于B基因型感染者的原因。美國(guó)的研究報(bào)道了CHB患者中D基因型更容易導(dǎo)致肝炎的發(fā)作，而瑞士的研究顯示A基因型較D型更容易慢性化。35歲前B基因型HBV易形成肝細(xì)胞癌(HCC)，而50歲以后C型HBV感染者比B基因型更易形成HCC。在所有年齡段內(nèi)，混合型的病毒載量和HBeAg陽(yáng)性率最高，提示混合型的HBV感染者較單個(gè)基因型感染者更容易形成HCC[20]。一般患者都會(huì)合并感染多于2個(gè)不同基因型的HBV，例如在亞洲的B和C基因型的合并感染，G基因型引發(fā)的慢性感染需要A基因型或H基因型的存在等。

不同基因型的HBV感染者對(duì)抗病毒治療的反應(yīng)也存在差異。一項(xiàng)臺(tái)灣的研究報(bào)道指出，干擾素治療后，B基因型的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率為41%，而同組中C基因型的轉(zhuǎn)換率僅為15%[21]，且基因型A和B對(duì)干擾素為基礎(chǔ)的治療比基因型C和D有更好的反應(yīng)。B基因型感染的預(yù)后一般較好，B基因型HBeAg陽(yáng)性的CHB患者對(duì)IFN-α治療的應(yīng)答率高于C基因型，A基因型患者高于D基因型。研究顯示B型CHB患者經(jīng)拉米夫定治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)率、HBeAg血清轉(zhuǎn)換率及ALT復(fù)發(fā)率均顯著高于B+C及C基因型CHB患者，這可能與C基因型預(yù)后不良有關(guān)[22]。B1基因亞型的患者比B2基因亞型具有更高的HBeAg陽(yáng)性率及拉米夫定耐藥的發(fā)生率。也有研究表明：C2基因亞型比B2基因亞型更易發(fā)生拉米夫定耐藥，在CHB患者中更明顯。目前有感染B2基因亞型的HCC患者術(shù)后易復(fù)發(fā)的報(bào)道[23]，提示基因型不僅與HCC的發(fā)生有密切關(guān)系，同時(shí)也影響著腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，有些基因型的臨床結(jié)果和治療反應(yīng)等仍存在爭(zhēng)議，如基因型D[24]等，為此還需要做進(jìn)一步的研究。

5　小　結(jié)

全球化和移民人口的增大加快了病毒株之間的分布和重組，如基因型A/D、A/E、C/D、G/C、D/F、A/F等的重組，由于重組導(dǎo)致基因片段在不同的病毒株之間的移動(dòng)是導(dǎo)致HBV多樣性的原因[25]，而移民是全球性HBV分布的混雜因素，大量的移民改變了HBV基因型的分布，導(dǎo)致了越來(lái)越多異國(guó)株的出現(xiàn)[26-27]。目前HBV基因分類(lèi)方法尚不完善，本領(lǐng)域的專(zhuān)家開(kāi)始關(guān)心那些新發(fā)現(xiàn)的亞型的分類(lèi)是否準(zhǔn)確。Pourkarim等[28]認(rèn)為分型時(shí)應(yīng)該系統(tǒng)地對(duì)病毒基因組進(jìn)行分析，而不是僅僅對(duì)部分序列進(jìn)行分析。Mahmoud等提出了新術(shù)語(yǔ)“recombino-亞型”和“immigro-亞型”；Pourkarim也同時(shí)認(rèn)為，對(duì)于重組株沒(méi)必要給予特定的分型，只需歸于重組亞型就好。HBV基因型的分類(lèi)存在很多復(fù)雜因素，對(duì)此還需要做更多的研究。

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2016-01-29修回日期：2016-05-06)

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃-昆醫(yī)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014FB094)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.033

A

1673-4130(2016)15-2136-04