周云題，姜　飛，陸召軍，耿德勤，劉　當

(1.徐州醫(yī)科大學，江蘇徐州 221002；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州221002)

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醫(yī)院內(nèi)感染碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥基因及同源性分析

周云題1，姜飛2，陸召軍1，耿德勤1，劉當1

(1.徐州醫(yī)科大學，江蘇徐州 221002；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州221002)

目的分析引起院內(nèi)感染的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(CRAB)耐藥基因及同源性。方法收集CRAB 40株，采用瓊脂稀釋法檢測最低抑菌濃度(MIC)；PCR檢測主要的碳青霉烯酶基因，PCR產(chǎn)物進行DNA測序分析；腸桿菌科基因間重復一致性序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)對耐藥菌株進行基因分型及同源性分析，質(zhì)粒接合試驗探討耐藥基因的可傳遞性。結(jié)果40株CRAB僅對多黏菌素B(100%)和頭孢哌酮/舒巴坦保持良好的敏感性(57.5%)，對其他藥物均產(chǎn)生不同程度耐藥；全部菌株均檢測出OXA-23和OXA-51基因；同源性分析顯示，按80%的聚類相似系數(shù)可將40株菌株分為4個型，A1型為主要流行株(19株)，且各科室存在交叉感染；質(zhì)粒接合試驗未獲成功。結(jié)論該院存在CRAB的流行傳播，其耐藥機制主要與OXA-23基因的表達有關(guān)；在合理使用抗菌藥物的同時，應(yīng)做好隔離及防護措施，盡量避免醫(yī)院內(nèi)交叉感染。

鮑曼不動桿菌；碳青霉烯類；醫(yī)院內(nèi)感染；OXA-23基因；同源性

2012年以來，徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌耐藥性不斷上升，特別是對碳青霉烯類藥物耐藥現(xiàn)象逐漸加重，部分菌株呈現(xiàn)出多重耐藥甚至泛耐藥現(xiàn)象，給臨床治療帶來極大的困擾。近期，臨床微生物室所分離出的鮑曼不動桿菌的藥敏譜極度相似，耐藥菌株主要來源于重癥監(jiān)護病房(ICU)，并存在院內(nèi)多個科室的交叉感染現(xiàn)象，懷疑這些菌株為同一克隆株。本研究擬對臨床分離的40株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(CRAB)的耐藥基因及同源性進行分析，以期了解該院CRAB的耐藥基因攜帶狀況以及是否存在克隆流行，為臨床控制耐藥菌株的產(chǎn)生和播散提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株來源40株CRAB為2014年6～10月臨床分離的非重復菌株，篩選標準為對亞胺培南和(或)美羅培南的最小抑菌濃度(MIC)>4 mg/L。所有分離菌株經(jīng)美國BD公司Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)，購自原衛(wèi)生部臨床檢驗中心，接合試驗受體菌為E.coli 600(利福平耐藥)，由北京武警總醫(yī)院胡紅焱老師惠贈。

1.2主要儀器與試劑Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏分析儀(美國BD公司)，PCR擴增儀ABI2720(美國ABI公司)，DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)，Bioshine GelX1850凝膠成像分析系統(tǒng)(上海歐翔科學儀器公司)，PCR Master Mix試劑盒(北京百泰克公司)，M-H瓊脂(英國Oxoid公司)；用于MIC試驗的藥物：氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦(珠海聯(lián)邦公司)、頭孢他啶(海南海靈公司)、環(huán)丙沙星(廣州南新公司)、亞胺培南(默沙東公司)、美羅培南(深圳海濱公司)、慶大霉素(辰欣藥業(yè)公司)、阿米卡星(齊魯制藥公司)、頭孢吡肟(深圳立健公司)、頭孢曲松(臺灣泛生公司)。

1.3藥敏試驗分離菌株經(jīng)美國BD公司Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏分析儀檢測后，采用瓊脂稀釋法檢測抗菌藥物MIC值，具體參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的方法執(zhí)行[1]。

1.4碳青霉烯酶基因檢測煮沸法提取細菌DNA。PCR擴增8種碳青霉烯酶基因，目的基因引物序列和片段長度見表1。引物參照文獻[2]設(shè)計，由上海捷瑞生物公司合成。反應(yīng)體系共50 μL，包括2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各3 μL，滅菌雙蒸水14 μL，DNA模板液5 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，經(jīng)35個循環(huán)，最后一個循環(huán)72 ℃延長至7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析，陽性條帶送上海捷瑞公司測序。

表1　目的基因PCR引物序列

1.5染色體DNA同源性分析重復一致性序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)分析耐藥菌株同源性，參考文獻[3]，擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，40 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)65 ℃ 16 min，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳后，用凝膠成像分析儀成像分析。

1.6同源性的判斷根據(jù)電泳指紋圖譜進行菌株同源性分析，將每個條帶轉(zhuǎn)換成二進制數(shù)據(jù)，“1”代表有，“0”代表無。利用NTSYS軟件，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進行聚類分析并構(gòu)建樹狀圖。判斷標準：聚類相似系數(shù)≥80%者為同一型別，若條帶大小和位置不同者為同一型別不同亞型；<80%者為不同型別。

1.7質(zhì)粒接合試驗挑取供、受體菌單個菌落接種于2 mL新鮮LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，各吸取供、受體菌菌液0.5 mL加到1.5 mL U型管中，37 ℃靜置培養(yǎng)4 h，吸取混合菌液100 μL均勻涂布于含美羅培南(1 mg/L)和利福平(128 mg/L)的M-H平板，37 ℃培養(yǎng)14 h，對生長出的菌落進行生化鑒定和藥敏試驗。

2　結(jié)　果

2.1藥敏試驗40株CRAB僅對多黏菌素B(100%)和頭孢哌酮/舒巴坦(57.5%)保持較好的敏感性，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株，絕大多數(shù)對其他抗菌藥物也耐藥。藥敏結(jié)果見表2。

2.2耐藥基因檢測40株CRAB全部擴增出OXA-23、OXA-51基因，未擴增出其他基因。隨機選擇PCR陽性產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，OXA-23、OXA-51與GenBank相關(guān)基因同源性均為100%。見圖1。

表2　40株CRAB藥敏試驗結(jié)果(mg/L)

注：1～3為OXA-51基因；4～6為OXA-23基因；M為DNA分子標志物。

圖1OXA-51、OXA-23基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3染色體DNA同源性分析結(jié)果ERIC-PCR同源性分析顯示，按照80%的聚類相似系數(shù)，40株CRAB可分為A、B、C、D 4型，除D型外，A、B、C型中均包含不同亞型，其中A1型為主要流行株，共19株，且存在ICU、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、內(nèi)分泌科等多個科室，有交叉感染現(xiàn)象。40株CRAB主要分離自痰液標本，ICU病區(qū)存在多種克隆菌株的混合感染，成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要科室。

2.4質(zhì)粒接合試驗結(jié)果將OXA-23陽性菌株進行質(zhì)粒接合試驗，結(jié)果美羅培南和利福平的雙抗平板均未見菌落生長，顯示本組檢測出的OXA-23基因不能通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移給受體菌。

3　討　論

碳青霉烯酶耐藥鮑曼不動桿菌克隆株的傳播是造成中國醫(yī)院感染鮑曼不動桿菌增加的重要原因[4]。據(jù)該院微生物室統(tǒng)計資料顯示，2013年鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率達到近70%，且耐藥菌株臨床分離率不斷上升。本研究分離的40株CRAB中絕大多數(shù)分離自ICU患者的痰液標本，這說明CRAB主要引起呼吸系統(tǒng)感染，這可能與ICU患者疾病嚴重，免疫力低下，長期使用廣譜抗生素及接受各種機械治療，進而發(fā)生感染概率增加有關(guān)。藥敏結(jié)果顯示，本組CRAB的藥敏譜極度相似，僅對多黏菌素B和頭孢哌酮/舒巴坦有較好的敏感性，其在對碳青霉烯類抗生素耐藥的同時，對其他類抗生素也存在高水平耐藥，從而呈現(xiàn)出多重耐藥甚至泛耐藥現(xiàn)象。因此，探究其耐藥機制對于指導臨床合理用藥、控制由耐藥菌株播散引起的院內(nèi)感染有重要意義。

產(chǎn)碳青霉烯酶是革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制。在鮑曼不動桿菌中，碳青霉烯酶主要是B類酶(金屬酶)和D類酶(苯唑西林酶)[5-8]。本研究40株CRAB經(jīng)PCR檢測全部擴增出OXA-51和OXA-23兩種D類碳青霉烯酶基因，未發(fā)現(xiàn)B類碳青霉烯酶基因。OXA-51基因被認為是鮑曼不動桿菌染色體攜帶的天然基因[9]。因此，該院鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物機制主要由OXA-23基因表達碳青霉烯酶所致。本研究CRAB中OXA-23基因的檢出率為100%，高于國內(nèi)其他研究的報道[10-11]，說明不同地區(qū)不同醫(yī)院耐藥基因的檢出率存在一定的差別，這可能與各地區(qū)各醫(yī)院的用藥習慣以及抗生素使用的監(jiān)控程度不同有關(guān)。ERIC-PCR同源性分析顯示，40株CRAB可分為A、B、C、D4型，A、B、C均出現(xiàn)亞型，D型為散在流行株。其中A1型克隆株達19株，來源于ICU、呼吸內(nèi)科等多個科室，說明其在該院存在多個科室的交叉感染。選取攜帶OXA-23基因的耐藥菌株進行質(zhì)粒接合試驗，陰性結(jié)果未能證明該基因可通過接合性質(zhì)粒進行傳播，分析其可能并非定位于接合性質(zhì)粒上，引起的傳播流行可能是耐藥菌株的傳播而非耐藥基因的傳播。

研究表明該院存在CRAB流行株的院內(nèi)交叉感染，其耐藥機制主要為產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶。控制和防止CRAB在院內(nèi)交叉感染甚至暴發(fā)流行，需要醫(yī)院感染管理部門、臨床醫(yī)生和臨床微生物工作者的共同努力，除了合理使用抗生素之外，做好隔離及防護措施，建立健全臨床分離菌株的耐藥性監(jiān)測亦是必不可少的重要舉措。

[1]Clinical Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:MS23-M100[S].Wayne,PA:CLSI,2013.

[2]王春新，耿先龍，許亞豐，等．泛耐藥鮑曼不動桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥機制研究[J]．中國抗生素雜志，2012，37(5)：329-334．

[3]陳軼堅，胡付品，黃海輝，等．耐碳青霉烯類抗生素不動桿菌屬的同源性分析[J]．中國感染與化療雜志，2012，12(2)：110-112．

[4]Zhou H,Yang Q,Yu YS,et al.Clonal spread of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii among different cities of China[J].J Clin Microbiol,2007,45(12):4054-4057.

[5]Khorsi K,Messai Y,Hamidi M,et al.High prevalence of multidrug-resistance in Acinetobacter baumannii and dissemination of carbapenemase-encoding genes blaOXA-23-like,blaOXA-24-like and blaNDM-1 in Algiers hospitals[J].Asian Pac J Trop Med,2015,8(6):438-446.

[6]Cicek AC,Saral A,Iraz M,et al.OXA- and GES-type β-lactamases predominate in extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii isolates from a Turkish University Hospital[J].Clin Microbiol Infect,2014,20(5):410-415.

[7]Jones LS,Toleman MA,Weeks JL,et al.Plasmid carriage of bla NDM-1 in clinical Acinetobacter baumannii isolates from India[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(7):4211-4213.

[8]Zhang R,Hu YY,Yang XF,et al.Emergence of NDM-producing non-baumannii Acinetobacter spp.isolated from China[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2014,33(5):853-860.

[9]Turton JF,Woodford N,Glover J,et al.Identification of acinetobacter baumannii by detection of the blaOXA-51-like carbapenemase gene intrinsic to this species[J].J Clin Microbiol,2006,44(8):2974-2976.

[10]邢麗丹，糜祖煌，徐鑫鑫，等．多重耐藥鮑曼不動桿菌中β內(nèi)酰胺酶基因的檢測[J]．中國感染與化療雜志，2014，14(1)：54-57．

[11]毛璞，邱桂霞，葉丹，等．重癥監(jiān)護病房碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制及同源性分析[J]．中國感染與化療雜志，2012，12(6)：449-452．

Analysis on drug-resistant genes and homology in nosocomial infection of carba penem-resistant Acinetobacter baumannii

ZHOU Yunti1，JIANG Fei2，LU Zhaojun1，GENG Deqin1，LIU Dang1

(1.XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221002，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221002，China)

ObjectiveTo analyze the drug resistance genes and homology in nosocomial infection caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii(CRAB).MethodsForty strains of CRAB were collected and the minimal inhibitory concentration(MIC) was detected by the agar dilution method.The main carbapenemase genes were detected by PCR.The PCR products were performed the DNA sequencing.The enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-polymerase chain reaction(PCR) was performed to analyze the genotypes and homology of these strains.The plasmid conjugation experiment was carried out to investigate the transmission of resistant genes.ResultsForty strains of CRAB maintained the good sensitivity only to polymyxin B (100%) and cefoperazone/sulbactam(57.5%).All of them had different degrees of resistance to other drugs.The OXA-23 and OXA-51genes were detected by PCR amplified in all of the CRAB strains.The homology analysis showed that the strains could be divided into 4 types according to 80% of cluster similarity coefficient,the type A1 (19 strains) was the major epidemic strain,moreover the various departments had cross infection;the plasmid conjugation experiment failed.ConclusionThere is an endemic spread of CRAB in our hospital and its resistant mechanism is mainly related with OXA-23 gene expression;in the rational antibiotics use at the same time,the isolation and prevention measures should be done well for avoiding the hospital cross infection.

Acinetobacter baumannii;carbapenem;nosocomial infection;OXA-23 gene;homology

2016-01-07修回日期：2016-05-17)

周云題，男，醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.020

A

1673-4130(2016)15-2105-03

·論著·