董志兵　陳云鵬浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江溫嶺　317500

抗IL-22抗體對IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影響

董志兵陳云鵬
浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江溫嶺317500

目的將IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠腹腔內(nèi)注射抗IL-22抗體，探討抗IL-22抗體對IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影響。方法將18只小鼠分為抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組，抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠建立病毒性心肌炎小鼠模型，建模當(dāng)天抗IL-22抗體組小鼠腹腔內(nèi)注射抗IL-22抗體50μg，病毒性心肌炎小鼠腹腔內(nèi)注射等體積PBS液，對照組小鼠不做任何處理。觀察建模2周時(shí)各組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒的復(fù)制情況、心肌炎性因子表達(dá)情況和血清IL-22蛋白、心肌IL-22mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果抗IL-22抗體組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒RNA和病毒滴度均明顯高于病毒性心肌炎組（P＜0.05）?？笽L-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于對照組（P＜0.05）；抗IL-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎組（P＜0.05）；病毒性心肌炎組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于對照組（P＜0.05）?？笽L-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均高于對照組（P＜0.05）；抗IL-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均低于病毒性心肌炎組（P＜0.05）；病毒性心肌炎組血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量均高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論抗IL-22抗體能夠加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的復(fù)制，降低小鼠心肌炎性因子的表達(dá)，降低小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA水平。

抗IL-22抗體；IL-17A基因；病毒性心肌炎；小鼠

［Abstract］Objective To inject anti-IL-22 antibody into IL-17A gene knockout viralmice intraperitoneal，and investigate the impactof anti-IL-22 antibody on IL-17A gene knockout viralmice.M ethods 18micewere divided into anti-IL-22 antibody group，viralmyocarditis group and control group，the anti-IL-22 antibody group and viralmyocarditis group were established viralmyocarditismousemodel.The anti-IL-22 antibody group mice were injected anti-IL-22 antibody 50μg by intraperitoneal，viralmyocarditis group mice were injected corresponding volume PBS by intraperitoneal，the control group mice received no treatment.Observed the copy of Nancy strain coxsackie virus，the expression ofmyocardialmyocarditis factor and serum IL-22 protein，myocardial IL-22mRNA expression at 2 weeks aftermodeling in each group mice.Results The nancy coxsackie virus RNA and viral titers of anti-IL-22 antibody group mice myocardium were significantly higher than viralmyocarditis group（P＜0.05）.The IFN-γmRNA content and TNF-αmRNA levels of anti-IL-22 antibody group were higher than control group（P＜0.05）；the IFN-γmRNA content and TNF-α mRNA levels of anti-IL-22 antibody group were lower than viralmyocarditis group（P＜0.05）；the IFN-γmRNA and TNF-αmRNA levels of viralmyocarditis group were higher than control group（P＜0.05）.The serum IL-22 protein and myocardial IL-22mRNA contents of anti-IL-22 antibody group were higher than control group（P＜0.05）；the serum IL-22 protein and myocardial IL-22 mRNA of anti-IL-22 antibody group were lower than viral myocarditis group（P＜0.05）；the serum IL-22 protein and myocardial IL-22 mRNA of viral myocarditis group were higher than control group（P＜0.05）.Conclusion Anti-IL-22 antibody could increase the viralmicemyocardium virus replication and reduce the expression ofmousemyocarditis factor，reducemice serum IL-22 protein and myocardial IL-22mRNA level.

［Key words］Anti-IL-22 antibody；IL-17A gene；Viralmyocarditis；Mice

病毒性心肌炎是心血管科比較常見的疾病之一，是心肌彌漫性或者局灶性的病變，常繼發(fā)于病毒、細(xì)菌、真菌等心肌感染后，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和心肌的變性壞死是其主要特征［1，2］?？滤_奇病毒B3是病毒性心肌炎主要的病原體之一［3，4］。IL-17是一種重要的炎性介質(zhì)，參與多種免疫細(xì)胞的增殖和趨化，能夠激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)生［5］，IL-17能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，導(dǎo)致自身免疫性心肌炎的心肌纖維化［6］。抗IL-22抗體能夠調(diào)節(jié)IL-22和IL-22R的表達(dá)，加重病毒性心肌炎小鼠心肌的炎癥反應(yīng)［7］。本研究將IL-17A基因敲除病毒性心肌炎小鼠腹腔內(nèi)注射抗IL-22抗體，探討抗IL-22抗體對IL-17A基因敲除小鼠病毒性心肌炎的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料

18只IL-17A基因敲除型、6周齡、雄性、SPF級BALB/c小鼠作為研究對象，18只小鼠均由東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所提供。

1.2主要試劑和儀器

PBS液（美國Sigma公司）、PCR Mix試劑盒（美國Sigma公司）、ELISA試劑盒（美國Sigma公司）、Anti-IL-22 Ab（美國Fermentas公司）等；離心機(jī)（德國SLEE公司）、酶標(biāo)儀（美國Amersham公司）、PCR儀（美國Amersham公司）等。

1.3方法

小鼠分組和處理：將18只小鼠隨機(jī)平均分為3組，抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組，每組6只，抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠腹腔內(nèi)注射含100TCID50的Nancy株柯薩奇病毒0.1mL建立病毒性心肌炎小鼠模型，建模當(dāng)天抗IL-22抗體組小鼠腹腔內(nèi)注射抗IL-22抗體50μg，病毒性心肌炎小鼠腹腔內(nèi)注射等體積PBS液，對照組小鼠不做任何處理。建模2周后各組小鼠摘除眼球取血后處死，取小鼠心臟備用。

小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒滴度評估：將小鼠心肌組織剪碎，加入PBS液，研磨成勻漿狀，加入PBS，凍融3次，離心，吸出上清液，加入PBS液，每管100μL分裝到小管中，采用空斑形成法評估抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒滴度。

各組小鼠血清IL-22蛋白含量測定：將小鼠血液離心后去血清，采用ELISA法進(jìn)行血清IL-22蛋白含量的測定。

各組小鼠心肌IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22mRNA的含量測定：采用RT-PCR法測定小鼠心肌組織中IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22 mRNA含量：常規(guī)提取小鼠心肌組織中的總RNA，3μL 總RNA加入到PCR反應(yīng)管中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)GenBank獲得目的基因和β-肌動蛋白基因序列，由Primer5.0設(shè)計(jì)引物，有上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物，PCR反應(yīng)條件：PCR總體積20μL，95.0℃預(yù)變性3min，95.0℃變性15 s，60.0℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用上△Ct法處理，計(jì)算小鼠心肌IFN-γmRNA、TNF-αmRNA和IL-22 mRNA的相對含量。

Nancy株柯薩奇病毒RNA采用RT-PCR法進(jìn)行測定。

1.4主要觀察指標(biāo)

觀察抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒的復(fù)制情況以及抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組小鼠心肌炎性因子和血清IL-22蛋白、心肌IL-22 mRNA的表達(dá)情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析，多組之間計(jì)量資料比較采用方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒的復(fù)制情況

由表1看出：抗IL-22抗體組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒RNA和病毒滴度均明顯高于病毒性心肌炎組（P＜0.01）。表明抗IL-22抗體加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的復(fù)制。

表1　抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠心肌CVB3病毒的復(fù)制情況（±s）

表1　抗IL-22抗體組和病毒性心肌炎組小鼠心肌CVB3病毒的復(fù)制情況（±s）

組別n Nancy株柯薩奇病毒RNA Nancy株柯薩奇病毒滴度（×104pfu/g）抗IL-22抗體組病毒性心肌炎組t值P 66 1.98±0.27 1.06±0.16 15.348 ＜0.001 10.87±1.23 0.94±0.02 67.425 ＜0.001

2.2抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組小鼠心肌炎性因子比較

由表2看出：抗IL-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于對照組（t值分別為8.263、5.316，P值分別為＜0.001、0.004）；抗IL-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎組（t值分別為9.452、7.157，P均＜0.001）；病毒性心肌炎組IFN-γmRNA含量和TNF-α mRNA含量均高于對照組（t值分別為15.241、14.374，P均＜0.001）。表明病毒性心肌炎組的炎性因子蛋白含量最高，抗IL-22抗體能夠降低病毒性心肌炎小鼠心肌炎性因子的表達(dá)。

表2　三組小鼠心肌炎性因子比較（±s）

表2　三組小鼠心肌炎性因子比較（±s）

組別n IFN-γmRNA含量TNF-αmRNA含量抗IL-22抗體組病毒性心肌炎組對照組F值P 666 1.45±0.21 2.52±0.24 1.01±0.03 12.164 ＜0.001 1.17±0.09 1.62±0.23 1.02±0.05 8.964 ＜0.001

2.3抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表達(dá)情況

由表3看出：抗IL-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于對照組（t值分別為4.157、4.633，P值分別為0.012、0.008）；抗IL-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均低于病毒性心肌炎組（t值分別為17.241、14.347，P均＜0.001）；病毒性心肌炎組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于對照組（t值分別為24.751、12.374，P值均為＜0.001）。表明病毒性心肌炎組小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA含量最高，抗IL-22抗體能夠降低病毒性心肌炎小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA水平。

表3　三組小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表達(dá)情況（±s）

表3　三組小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22mRNA的表達(dá)情況（±s）

組別n血清IL-22蛋白（pg/mL）心肌IL-22mRNA 抗IL-22抗體組病毒性心肌炎組對照組F值P 666 11.8±1.7 16.5±1.9 2.1±0.8 13.512 ＜0.001 3.58±0.34 4.19±0.45 1.07±0.09 11.527 ＜0.001

3　討論

病毒性心肌炎可以很快發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病或者慢性心肌炎，甚至發(fā)生心力衰竭，是年輕患者發(fā)生心源性猝死的常見原因之一［8-10］?？滤_奇病毒是病毒性心肌炎常見的病原體之一［11］，免疫介導(dǎo)的損傷和細(xì)胞毒性的直接作用在心肌病理損傷中發(fā)揮重要作用，其中T細(xì)胞在炎癥和免疫反應(yīng)中扮演主要角色：殺傷性T細(xì)胞能夠介導(dǎo)細(xì)胞裂解；Th1細(xì)胞能夠介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤的炎癥反應(yīng)［12，13］。Th17細(xì)胞在多種免疫性疾病中出現(xiàn)過度激活和多克隆狀態(tài)，主要分泌腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-17以及白細(xì)胞介素17A等細(xì)胞因子，參與教導(dǎo)免疫細(xì)胞的局部浸潤，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17參與多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程［14，15］。IL-17A的表達(dá)異常和多種纖維化性疾病關(guān)系也比較密切，參與心肌纖維化等纖維化疾病的發(fā)生和發(fā)展，IL-17A引起心肌纖維化的過程主要通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，參與免疫性心肌炎的心肌纖維化［16，17］。

IL-22是IL-10家族成員，由免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生，IL-22作用于IL-22受體，活化其下游通路，IL-22參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及病毒感染等過程越來越受到重視，IL-22生物學(xué)效應(yīng)比較復(fù)雜，既具有致病性作用，也具有保護(hù)性作用，在同一疾病的發(fā)生過程中，IL-22可能發(fā)生相反的短期效應(yīng)和長期效應(yīng)［18，19］。IL-22參與IL-17介導(dǎo)的多種疾病，兩者共同作用引起抗炎因子的產(chǎn)生，IL-22在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用還是促炎作用可能有IL-17調(diào)節(jié)，在不同的組織和細(xì)胞微環(huán)境下，有無IL-17A的表達(dá)，IL-22對組織發(fā)揮保護(hù)作用還是破壞作用不同［20］。本研究通過將18只小鼠分為抗IL-22抗體組、病毒性心肌炎組和對照組，建立病毒性心肌炎小鼠模型，抗IL-22抗體組小鼠腹腔內(nèi)注射抗IL-22抗體，病毒性心肌炎小鼠腹腔內(nèi)注射PBS液，觀察各組小鼠心肌柯薩奇病毒的復(fù)制情況、心肌炎性因子表達(dá)情況和血清IL-22蛋白、心肌IL-22mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗IL-22抗體組小鼠心肌Nancy株柯薩奇病毒RNA和病毒滴度均明顯高于病毒性心肌炎組?？笽L-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于對照組；抗IL-22抗體組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均低于病毒性心肌炎組；病毒性心肌炎組IFN-γmRNA含量和TNF-αmRNA含量均高于對照組?？笽L-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于對照組；抗IL-22抗體組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均低于病毒性心肌炎組；病毒性心肌炎組血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA含量均高于對照組。由此可見，抗IL-22抗體能夠加重病毒性心肌炎小鼠心肌病毒的復(fù)制，降低小鼠心肌炎性因子的表達(dá)，降低小鼠血清IL-22蛋白和心肌IL-22 mRNA水平。在沒有IL-17A共表達(dá)的情況下，IL-22對心肌炎癥發(fā)揮保護(hù)作用，IL-17A和IL-22相互作用能夠調(diào)節(jié)TNF-α等炎性因子的表達(dá)，在沒有IL-17A的共同表達(dá)情況下，阻斷IL-22能夠減少病毒性心肌炎小鼠心肌中的TNF-α等水平。Th1能夠增加急性炎癥的發(fā)展，但能夠抑制病毒復(fù)制和心肌炎的發(fā)展，抗IL-22抗體組IFN-γ表達(dá)量減少，可能和病毒復(fù)制增加、心肌炎癥減輕有關(guān)。在沒有IL-17A的環(huán)境中，IL-22也能減少病毒的復(fù)制。由此可見，在沒有IL-17A表達(dá)的情況下，IL-22能夠抑制心肌病毒的復(fù)制，其機(jī)制可能和IL-22促進(jìn)TNF-α和IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。

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Influences of antiIL-22 antibody on IL-17A gene knockout viralm ice

DONG Zhibing CHEN Yunpeng
Department of Cardiovascular Medicine，Wenling First People's Hospital in Zhejiang Province，Wenling 317500，China

R542.2

A

1673-9701（2016）15-0019-04

浙江省溫嶺市第二批科技項(xiàng)目（2011WLCB0087）

2016-02-18）