李永蓮，劉文鋒，陽元娥，龔盛昭

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 科研處，廣東 廣州 510300；2.五邑大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 江門 529020）

科技與應(yīng)用

西藏栽培天麻和野生天麻中天麻素和檸檬酸的含量測定

李永蓮1，劉文鋒2*，陽元娥1，龔盛昭1

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 科研處，廣東 廣州 510300；2.五邑大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 江門 529020）

【目的】測定西藏的普通栽培天麻、有機(jī)肥栽培天麻與野生天麻中天麻素和檸檬酸的含量?！痉椒ā坎捎肦P-HPLC法。色譜柱Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25℃；檢測波長分別為：220 nm和214 nm；流動相分別為：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）和0.8%NH4H2PO4水溶液。對西藏的普通栽培天麻、有機(jī)肥栽培天麻與野生天麻中的天麻素和檸檬酸進(jìn)行含量測定?！窘Y(jié)果】不同栽培方式得到的天麻中天麻素含量分別為：0.12%，0.14%和0.24%；檸檬酸的含量分別為：0.0234%，0.0298% 和0.0266%：野生天麻中天麻素的平均回收率為98.20%（n=6）；檸檬酸的平均回收率為95.49%（n=5）?！窘Y(jié)論】不同的栽培方式對天麻中天麻素和檸檬酸的含量影響較大，其中野生天麻樣品中天麻素含量最高，檸檬酸的含量僅次于普通栽培天麻。

天麻；天麻素；檸檬酸；HPLC

天麻（Gastrodia elata）為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，主產(chǎn)于我國西藏、貴州、四川及云南等地［1］，可用于治療頭痛、頭暈、失眠、偏頭疼、手足抽搐、小兒驚風(fēng)、高血壓和神經(jīng)衰弱等等［2］。天麻含有多種活性成分［3-4］，其中主要成分為天麻素和檸檬酸［5］等。天麻素具有滋腎補(bǔ)腦、提神益氣、降低血管血壓、抗自由基和保護(hù)細(xì)胞膜等藥理作用；而檸檬酸具有抗氧化、抗癌、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒等藥理作用，在藥物治療的過程中起著重要的作用［6］。自20世紀(jì)70年代以來，野生天麻由于種植地域的局限性，不能滿足日益增長的用藥需求，因此人工種植天麻逐漸擴(kuò)大規(guī)模以滿足市場的需求量。然而，不同地域、不同栽培方式種植的天麻質(zhì)量參差不齊，主要活性成分含量（如天麻素和檸檬酸）相差很大，所以評價野生天麻與不同栽培方式（普通栽培和有機(jī)肥栽培）的天麻品質(zhì)，在藥用價值與食用價值上均有著重要的意義。目前天麻品質(zhì)的評價主要集中于天麻素的含量和活性研究，而對天麻中檸檬酸的含量研究較少，因此本文通過HPLC法測定和比較西藏地區(qū)普通栽培、有機(jī)肥栽培天麻與野生天麻的天麻素和檸檬酸含量，對不同栽培方式得到的天麻與野生天麻進(jìn)行研究，為天麻品質(zhì)的鑒定提供可靠的測試方法和理論依據(jù)。

1　材料

1.1藥材

天麻樣品：1號天麻（普通栽培），2號天麻（有機(jī)肥栽培），3號天麻（野生），均采自西藏，以上藥材烘干，磨碎成粉，過篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

天麻素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：080729903），購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2儀器

電熱恒溫水溫箱（上海悅豐儀器儀表有限公司，型號：HH.W21-420S），KH2200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），高效液相色譜儀（UV230+紫外-可見檢測器，P230高壓恒流泵）（廣州廣一科學(xué)儀器有限公司），EC2000色譜數(shù)據(jù)處理工作站（大連依利特分析儀器有限公司，型號：D3204S00）。

1.3試劑

乙腈和甲醇（廣州試劑廠）為色譜純?nèi)軇疄樽灾贫握麴s水，其它試劑均為分析純?nèi)軇?/p>

2　實驗方法

2.1樣品制備

1）天麻素樣品的制備。準(zhǔn)確稱取恒重的天麻樣品約0.100 0 g，加入50%乙醇6.0 mL，稱重。調(diào)節(jié)水浴溫度為70℃，加熱回流提取3 h，冷卻后再稱重。減失的重量用50%乙醇補(bǔ)足，濾過，將濾液濃縮至近干，得殘渣，用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用流動相稀釋至刻度線，搖勻。使用直徑為0.45 μm微孔濾膜過濾溶液2次，目的是為了濾去溶液中的不溶性殘渣，然后將過濾所得的濾液經(jīng)超聲脫氣后以備后續(xù)使用，即得待測天麻素樣品。

2）檸檬酸樣品的制備。稱取恒重的天麻粉末樣品約0.100 0 g，置于25 mL圓底燒瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇25 mL，稱重。于70℃水浴加熱回流提取3次，每次1 h，冷卻后再稱重，減失的重量用甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，取濾液，濃縮至近干，用流動相溶解殘渣，待溶解后將其轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用流動相稀釋至刻度線，搖勻。使用直徑為0.45 μm微孔濾膜過濾溶液2次，目的是為了濾去溶液中的不溶性殘渣，然后將過濾所得的濾液經(jīng)超聲脫氣后以備后續(xù)使用，即得待測檸檬酸樣品。

2.2標(biāo)準(zhǔn)品制備

1）天麻素標(biāo)準(zhǔn)品的制備。準(zhǔn)確稱取不同量的天麻素標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，加入流動相溶解并定容至刻度，搖勻，分別配制成濃度為25、50、75、100、125 mg/mL天麻素標(biāo)準(zhǔn)液。

2）檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備。稱取不同量的檸檬酸，置于10 mL容量瓶中，加入流動相溶解并定容至刻度，搖勻，分別配制濃度為0、2.0、5.0、7.0、10.0 g/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3色譜條件

1）天麻素含量測定的色譜條件［7］。色譜柱：Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫：25℃；檢測波長：220 nm；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97），流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2）檸檬酸含量測定的色譜條件［8］。色譜柱：Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5μm），檢測波長：214 nm；柱溫：25℃；流動相：0.8%NH4H2PO4水溶液，流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

3　實驗結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取10 μL天麻素標(biāo)準(zhǔn)液和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液注入，按上述色譜條件測定峰面積。分別以天麻素進(jìn)樣量和檸檬酸進(jìn)樣量為X坐標(biāo)，峰面積值為Y坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1（天麻素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖）和圖2（檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖）所示。天麻素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程為：Y=1 816.6X-18.533，R=0.999 1，結(jié)果表明天麻素在0.20～0.80 μg范圍內(nèi)峰面積Y與進(jìn)樣量X呈良好的線性關(guān)系；而檸檬酸的回歸方程為：Y=678.35X+13.007，R=0.999，同樣表明在2.0～10.0 g/L范圍內(nèi)峰面積Y與濃度X的線性關(guān)系良好。

圖1　天麻素標(biāo)準(zhǔn)樣高效液相色譜圖

圖2　檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)樣高效液相色譜圖

3.2樣品的含量測定

分別精確稱取天麻樣品1、2和3，按照前述步驟處理、制備并進(jìn)行色譜分析，每個樣品進(jìn)樣量為10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，見表1和表2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算樣品中天麻素和檸檬酸的含量。結(jié)果表明：1）3個天麻樣品中，只有西藏野生天麻的天麻素含量高于0.20%，符合中國藥典對天麻藥材中對于天麻素含量的規(guī)定（≥0.20%）［9］。2）有機(jī)肥栽培的天麻中檸檬酸的含量最高，野生天麻中檸檬酸的含量次之，而普通方法栽培的天麻中檸檬酸的含量最低。由此可進(jìn)一步得出結(jié)論：檸檬酸的含量與天麻的種植條件密切相關(guān)。

表1　天麻中天麻素含量測定結(jié)果（n=6）

表2　天麻中檸檬酸含量測定結(jié)果（n=5）

3.3HPLC方法考察

1）精密度實驗。

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液10 μL，進(jìn)樣若干次（n=6或5），測得天麻素峰面積的RSD為0.75%，檸檬酸峰面積的RSD為1.31%，實驗表明該方法精密度較好。

2）穩(wěn)定性實驗。

準(zhǔn)確吸取同一天麻樣品溶液10 μL，每隔4 h進(jìn)樣1次，進(jìn)樣若干次（n=6或5），測得天麻素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%，檸檬酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.73%，結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3）重現(xiàn)性實驗。

取同一批天麻樣品，平行制作，測得天麻素含量的RSD為1.66%～2.06%，檸檬酸含量的RSD為 1.31%～2.11%，測試結(jié)果表明此方法對測定天麻素和檸檬酸含量的重復(fù)性較好。

4）加樣回收率試驗。

在平行的若干份（n=6或5）天麻樣品1中，加入一定量的對照品，制成待測樣品，測定天麻素和檸檬酸的含量，其中測得天麻素的平均回收率為98.20%（表3）；而檸檬酸的平均回收率為95.49%（表4）。這些結(jié)果顯示本實驗的回收率良好。

表3　天麻中天麻素加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

表4　天麻中檸檬酸加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

4　結(jié)論

從采用HPLC對西藏普通栽培天麻、有機(jī)肥栽培天麻與野生天麻中的天麻素檢測結(jié)果來看，三者有明顯的差異，可有效地加以區(qū)分。從普通栽培天麻、有機(jī)肥栽培天麻與野生天麻中的檸檬酸的檢測結(jié)果看，差異較小，但是可有效地區(qū)分。結(jié)果表明，野生天麻中天麻素含量最高，檸檬酸的含量僅次于普通栽培天麻。綜合上述結(jié)果可知野生天麻的品質(zhì)最高，比普通栽培以及有機(jī)肥栽培的天麻更具藥用價值和食用價值。本方法分辨力強(qiáng)，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及回收率良好，因此通過HPLC對天麻中的天麻素和檸檬酸的含量進(jìn)行測定是科學(xué)可行的方法。

［1］劉小琴，汪鋆植，袁琴，等.天麻不同品種及不同組織中天麻素的含量比較［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：908-909.

［2］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草：第8卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:716.

［3］周俊，楊雁賓，楊崇仁.天麻的化學(xué)研究Ⅰ：天麻化學(xué)成分的分離和鑒定［J］.化學(xué)學(xué)報，1979，37（3）: 183-189.

［4］王亞男，林生，陳明華，等.天麻水提取物的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（12）：1775-1781.

［5］岑信釗.天麻的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥材，2005，28（10）：958-962.

［6］湯喜蘭，劉建勛，李磊.中藥有機(jī)酸類成分的藥理作用及在心血管疾病的應(yīng)用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：243-246.

［7］程芬，張焜，趙肅清，等.波密栽培天麻與野生天麻中三種有效成分的含量測定［J］.中藥材，2009，32（7）：1028-1030.

［8］唐慧慧，蔡清宇，毛翼.HPLC法測定凈烏梅及烏梅炭中檸檬酸和蘋果酸的含量［J］.中藥材，2007，30（1）：52-54.

［9］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中藥醫(yī)藥科技出版社，2010.

［責(zé)任編輯：吳卓］

Determination of Gastrodin and Citric Acid Derived from Different Cultivation of Gastrodia Elata in Tibet

LI Yonglian1，LIU Wenfeng2*，YANG Yuan'e1，GONG Shengzhao1
（1.Guangdong Industry of Technical College，Guangzhou Guangdong 510300，China；2.School of Chemical&Environmental Engineering，Wuyi University，Jiangmen Guangdong 529020，China）

Objective To determine the contents of gastrodin and citric acid from different cultivation of gastrodia elata in Tibet by HPLC.Methods High-performance liquid chromatography（HPLC）was conducted on Hypersil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）with a mobile phase of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（3:97）and 0.8%NH4H2PO4 solution at a detection wavelength of 220 nm and 214 nm respectively.Results The content of gastrodin from different cultivation of gastrodia elata were 0.12%，0.14%and 0.24%，and the content of citric acid were 0.0234%，0.0298%and 0.0266%. The average recovery rate of gastrodin from nature was 98.20%（n=6），and the content of citric acid was 95.49%（n=5）. Conclusion There are significant differences in the content of gastrodin and citric acid between different cultivation of gastrodia elata in Tibet.

gastrodia elata；gastrodin；citric acid；HPLC

R282.5

A

1672-6138（2016）03-0023-05

10.3969/j.issn.1672-6138.2016.03.005

2016-06-02

廣州市科技局項目（2014J4100002）。

李永蓮（1985—），女，廣東韶關(guān)人，工程師，碩士，研究方向：天然藥物的開發(fā)與利用。

劉文鋒（1986—），男，廣東韶關(guān)人，講師，博士，E-mail：wyuchemlwf@126.com。