鄧日強，楊印樓，張宏華，程江濤，劉清毅，謝 斌，侯紅梅

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·論著·

蚤休薯蕷皂苷聯(lián)合順鉑治療肺腺癌小鼠的療效及其作用機制研究

鄧日強，楊印樓，張宏華，程江濤，劉清毅，謝 斌，侯紅梅

512026廣東省韶關市，粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

【摘要】目的探討蚤休薯蕷皂苷(RD)聯(lián)合順鉑治療肺腺癌小鼠的療效及其作用機制。方法2015年12月，選取SPF級雄性T739小鼠48只，接種腫瘤細胞4 d后隨機分為對照組、順鉑組、RD組、順鉑+RD組，每組12只。對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，順鉑組小鼠接種腫瘤細胞后第5、12、19天腹腔注射順鉑，RD組小鼠接種腫瘤細胞4 d后腹腔注射RD，順鉑+RD組小鼠腹腔注射順鉑+RD。接種腫瘤細胞后第31天處死各組小鼠，比較4組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積、腫瘤重量、抑瘤率、肺表面轉移結節(jié)數(shù)，血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)水平，瘤組織中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管生成抑制蛋白(VASH)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)表達情況。結果順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于對照組，腫瘤體積小于對照組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于對照組(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于順鉑組、RD組，腫瘤體積小于順鉑組、RD組，抑瘤率高于順鉑組、RD組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于順鉑組、RD組(P<0.05)。順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于對照組(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于順鉑組、RD組(P<0.05)。順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于對照組(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于順鉑組、RD組(P<0.05)。結論RD聯(lián)合順鉑能有效抑制小鼠肺腺癌細胞生長，降低血清VEGF、MMP-2水平及腫瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF的表達。

【關鍵詞】腺瘤病，肺；順鉑；蚤休薯蕷皂苷；中西醫(yī)結合療法

鄧日強，楊印樓，張宏華，等.蚤休薯蕷皂苷聯(lián)合順鉑治療肺腺癌小鼠的療效及其作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(7)：56-60.[www.syxnf.net]

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肺腺癌源于支氣管黏膜或腺體[1]，其傾向于管外生長，也可循泡壁蔓延，癌瘤內(nèi)血管豐富，局部浸潤和血行轉移發(fā)生較早，患者預后極差[2]?；熢诜蜗侔┑闹委熤芯哂兄匾匚?，抗腫瘤化療藥物有抑制癌細胞生長、增殖和殺滅癌細胞的作用，但常用的化療藥物多存在骨髓抑制、神經(jīng)毒性、肝腎功能損傷、胃腸道反應等毒副作用，且部分化療藥物可產(chǎn)生耐藥性，導致其臨床應用有限，故臨床加強肺腺癌綜合治療的研究十分必要[3]。目前，隨著現(xiàn)代中醫(yī)學的發(fā)展，從中草藥中獲取抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤研究的新熱點。蚤休薯蕷皂苷(RD)是一種新型抗腫瘤藥物[4]，其是從中藥材蚤休中提取出的甾體皂苷(蚤休皂苷)，現(xiàn)代藥理學研究表明，該成分具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能及免疫調(diào)節(jié)等作用。目前，臨床有關RD治療肺腺癌小鼠的較少。本研究通過建立肺腺癌小鼠模型，旨在探討RD聯(lián)合順鉑治療肺腺癌小鼠的療效及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物2015年12月，選取SPF級T739小鼠48只，均為雄性，周齡4～5周，體質(zhì)量18～22 g，購于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院動物實驗室，動物合格證號：SCXK11-00-0005；飼養(yǎng)條件：12 h光照，室溫23～25 ℃，相對濕度40%～60%。另選取LA795肺腺癌荷瘤鼠 2 只，由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院動物實驗室提供。

1.1.2實驗藥物RD由天津馬克生物技術有限公司生產(chǎn)，薯蕷皂苷單體純度>95%；順鉑：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20040813，規(guī)格：6 ml∶20 mg×5瓶/盒。

1.1.3實驗試劑人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA定量檢測試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司；人基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA試劑盒購自北京方程生物有限公司；免疫組化檢測試劑盒購自上海一研生物科技有限公司；Anti-HIF-1 Alpha抗體購自上海微蒙酶聯(lián)試劑公司；Anti-VASH1抗體購自上海博研生物工程研究中心；Anti-BFGF/FGF-2抗體購自上海研生生化試劑有限公司。

1.1.4實驗儀器ELX800酶標儀由美國Biotek公司提供；MODEL 550臺式冰凍離心機；BP110S型電子天平由德國Sartorins公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1建立模型無菌條件下斷頸處死LA795肺腺癌荷瘤鼠后剝離瘤塊，取腫瘤組織1 g+0.9%氯化鈉溶液4 ml后放入表面皿內(nèi)，剪碎腫瘤于勻漿機內(nèi)研磨獲取勻漿液，選擇360目鋼網(wǎng)過濾獲得腫瘤細胞懸液，置入離心管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉溶液，顯微鏡下調(diào)整細胞濃度達到2×106個/ml，后于T739小鼠右后腿根部外側皮下注射腫瘤細胞懸液0.2 ml，獲得小鼠皮下腫瘤動物模型。

1.2.2分組接種腫瘤細胞4 d后將所有T739小鼠隨機分為對照組、順鉑組、RD組、順鉑+RD組，每組12只。(1)對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，0.2 ml/次，1次/d，共26次。(2)順鉑組小鼠接種腫瘤細胞第5、12、19天腹腔注射順鉑，劑量為3 mg/kg，1次/d。(3)RD組小鼠接種腫瘤細胞4 d后腹腔注射RD，劑量為5 μg/kg，1次/d，共26次。(4)順鉑+RD組小鼠腹腔注射順鉑+RD，順鉑與RD的用法用量同上。接種腫瘤細胞后第31天處死各組小鼠。

1.3觀察指標比較4組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積〔計算公式：V=0.52×a2×b(a為短徑，b為長徑，V為體積)〕、腫瘤重量、抑瘤率〔抑瘤率=(1-ET/EC)×100%〕(EC為對照組平均瘤重，ET為治療組平均瘤重)〕、肺表面轉移結節(jié)數(shù)，血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)水平，瘤組織中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管生成抑制蛋白(VASH)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)表達水平。

1.3.1肺表面轉移結節(jié)數(shù)處死小鼠后剖胸取出小鼠兩肺后稱兩肺濕重，剝?nèi)∑は乱浦材[瘤及一側肺組織標本，采用中性甲醛溶液固定，石蠟包理，組織切片，HE染色，光鏡觀察；另一側肺組織置入液固定1 d，待肺組織收縮，轉移瘤結節(jié)突出可見后取出，記錄肺表面轉移結節(jié)數(shù)。

1.3.2血清VEGF、MMP-2水平采集大鼠尾部靜脈血5 ml，3 200 r/min離心5 min，采用ELISA 檢測各組小鼠血清VEGF、MMP-2水平，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平腫瘤組織切片脫蠟至水，選擇相應抗體作為一抗，選擇生物素標記的羊抗兔抗體作為二抗，采用免疫組化染色檢測各組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達情況，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4免疫組化判定方法HIF-1α主要表達于細胞核和細胞質(zhì)；b-FGF主要表達于腫瘤細胞或腫瘤間質(zhì)細胞內(nèi)；VASH主要表達于細胞質(zhì)或細胞核，呈黃色、棕黃色、褐色。采用Image-Proplus 6.0圖像處理系統(tǒng)進行圖片處理。

2　結果

2.1體質(zhì)量、腫瘤體積、腫瘤重量、抑瘤率、肺表面轉移結節(jié)數(shù)4組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積、腫瘤重量、抑瘤率、肺表面轉移結節(jié)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于對照組，腫瘤體積小于對照組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于順鉑組、RD組，腫瘤體積小于順鉑組、RD組，抑瘤率高于順鉑組、RD組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于順鉑組、RD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of body mass，tumor volume，tumor weight，tumor inhibition rate and lung surface metastatic nodules number among the four groups

組別只數(shù)體質(zhì)量(g)腫瘤體積(cm3)腫瘤重量(g)抑瘤率(%)肺表面轉移結節(jié)(個)對照組1226.0±1.811.3±2.58.9±2.1-5.3±1.7順鉑組1224.1±1.7ab4.6±1.6ab4.3±1.3ab51.69±6.21b1.9±0.8abRD組1224.5±2.0ab6.9±2.1ab5.7±1.5ab35.96±5.50b2.8±1.1ab順鉑+RD組1223.8±1.9a2.8±1.4a2.4±1.2a73.03±8.940.8±0.4aF值7.91638.67122.09427.81555.033P值0.038<0.001<0.001<0.001<0.001

注：RD=蚤休薯蕷皂苷；與對照組比較，aP<0.05，與順鉑+RD組比較，bP<0.05；“-”表示無相關數(shù)據(jù)

2.2血清VEGF、MMP-2水平4組小鼠血清VEGF、MMP-2水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于順鉑組、RD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平4組小鼠HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于順鉑組、RD組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3，見圖1～3)。

Table 2Comparison of serum levels of VEGF and MMP-2 among the four groups

組別只數(shù)VEGF(ng/L)MMP-2(μg/ml)對照組12127.41±30.85319.62±47.83順鉑組1257.09±16.60ab215.66±28.97abRD組1288.17±19.96ab263.92±39.05ab順鉑+RD組1241.38±13.72a163.39±29.64aF值33.72642.095P值<0.001<0.001

注：VEGF=血管內(nèi)皮生長因子，MMP-2=基質(zhì)金屬蛋白酶2；與對照組比較，aP<0.05，與順鉑+RD組比較，bP<0.05

Table 3Comparison of expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues among the four groups

組別只數(shù)HIF-1αVASHb-FGF對照組1236178.2±4829.113094.2±2208.614149.7±2681.4順鉑組1224987.3±2208.6ab9278.0±1883.9ab9833.0±2267.5abRD組1229879.5±3382.7ab11037.6±1966.4ab11985.7±2316.6ab順鉑+RD組1218693.9±2614.0a6630.9±1553.2a6993.2±1982.1aF值16.39518.03321.432P值<0.001<0.001<0.001

注：HIF-1α=缺氧誘導因子1α，VASH=血管生成抑制蛋白，b-FGF=堿性成纖維細胞生長因子；與對照組比較，aP<0.05，與順鉑+RD組比較，bP<0.05

注：A為對照組，B為順鉑組，C為RD組，D為順鉑+RD組

圖14組小鼠瘤組織中HIF-1α表達情況(HE染色，×400)

Figure 1Expressions of HIF-1α in tumor tissues of the four groups

圖3　4組小鼠瘤組織中b-FGF表達情況(HE染色，×400)

3　討論

3.1肺腺癌常規(guī)化療的缺陷有研究顯示，肺癌的組織學亞型主要為鱗癌，腺癌約占5%[5]。近50年來，肺腺癌的發(fā)病率迅速升高，目前其已占全部肺癌的47%以上。肺腺癌傾向于管外生長，也可循泡壁蔓延，癌瘤內(nèi)血管豐富，局部浸潤和血行轉移發(fā)生較早，患者預后極差、病死率較高[6]。化療作為治療肺腺癌的主要手段之一，其療效較好，可明顯抑制癌細胞的生長、增殖，并殺滅癌細胞。多數(shù)常規(guī)化療藥物具有骨髓抑制、神經(jīng)毒性、肝腎功能損傷及胃腸道反應等毒副作用[7]，使患者機體組織及正常細胞受損，部分化療藥物可導致患者出現(xiàn)耐藥性，故其臨床應用有限。趙瀟等[8]研究表明，RD具有下調(diào)胰腺癌患者PRDX1表達的作用，可造成活性氧簇(ROS)過度蓄積，導致細胞凋亡，已成為臨床研究熱點。

3.2順鉑聯(lián)合RD治療肺腺癌的可行性近年來，有研究者從中藥及天然植物中提取出毒副作用較低的抗腫瘤有效成分，RD是一種由傳統(tǒng)中藥材蚤休主要有效成分甾體皂苷合成的抗腫瘤新藥[8]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，RD具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)功能等作用。有研究表明，RD具有較強殺滅腫瘤細胞的作用[9]，且不損傷正常細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，RD對膠質(zhì)瘤細胞有明顯的抑制作用，其作用機制與上調(diào)脂肪酸合成酶(FAS)、半胱氨酸蛋白酶8(CASPASE-8)和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達及促進細胞凋亡有關[10]。有研究通過建立H22荷瘤肝癌小鼠模型，分別使用蚤休高、低劑量和環(huán)磷酰胺對模型小鼠進行腹腔灌洗[11]，結果顯示，蚤休能明顯抑制腫瘤生長，提高血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素2(IL-2)水平。本研究結果顯示，順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于對照組，腫瘤體積小于對照組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于對照組；順鉑+RD組小鼠體質(zhì)量、腫瘤重量低于順鉑組、RD組，腫瘤體積小于順鉑組、RD組，抑瘤率高于順鉑組、RD組，肺表面轉移結節(jié)數(shù)少于順鉑組、RD組。提示順鉑聯(lián)合RD能增強化療效果，且腫瘤抑制率較高，提示本研究綜合治療肺腺癌方案具有可行性。

3.3順鉑復合RD治療肺腺癌的作用機制有研究顯示，腫瘤細胞增殖可造成腫瘤內(nèi)部組織缺氧，使腫瘤細胞快速增殖并出現(xiàn)耐藥性，而腫瘤細胞會通過自身調(diào)節(jié)適應其內(nèi)部微環(huán)境變化，從而造成HIF-1α等相關因子的表達出現(xiàn)變化[12]。缺氧條件下HIF-1α信號分子可與相關受體結合，刺激絡氨酸蛋白激酶活性高表達，產(chǎn)生級聯(lián)反應激活PI3K及促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路，引起HIF-1α表達水平升高，同時其在缺氧狀態(tài)下還可驅(qū)動腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，導致腫瘤下游血管生成因子轉錄，生成大量腫瘤新生血管，促進惡性腫瘤生長。b-FGF及VEGF均可與其受體結合，基于Mek/Erk 通路促進成纖維細胞生長因子(FGF)結合蛋白表達水平上升，可誘導新腫瘤血管生成，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、趨化，同時可降解基底膜、提高血管通透性、增強腫瘤細胞的侵襲能力。VASH-1作為一種血管生成負反饋抑制因子，首次發(fā)現(xiàn)于VEGF或b-FGF誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞DNA微陣列中。有研究表明，VASH-1高表達于惡性腫瘤細胞內(nèi)，并與HIF-1α表達呈正相關[13]。本研究結果顯示，順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于對照組；順鉑+RD組小鼠瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平低于順鉑組、RD組。提示順鉑聯(lián)合RD可降低肺腺癌組織中HIF-1α、VASH、b-FGF表達水平，抑制腫瘤新生血管生成、生長、侵襲及轉移能力。分析原因可能為RD可通過抑制缺氧條件下肺腺癌腫瘤細胞b-FGF表達，并阻斷其基于PI3K通路對VEGF釋放的刺激，影響條件血管內(nèi)皮生長因子受體功能，從而降低HIF-1α和VASH的表達。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可降解細胞外基質(zhì)及基底膜，增強腫瘤細胞侵襲及轉移能力：(1)損壞腫瘤細胞間質(zhì)膜物理屏障，重塑腫瘤細胞黏附力，使腫瘤細胞突破屏障向周圍組織轉移；(2)激活基質(zhì)潛在的生物活性，引導腫瘤免疫逃逸；(3)改變細胞外基質(zhì)生理性，誘導形成腫瘤新血管。故MMPs是降解細胞基底膜的高效酶類，其中MMP-2可有效促進腫瘤侵襲和轉移，惡性腫瘤常伴有高表達的MMP-2[14-15]。本研究結果顯示，順鉑組、RD組、順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于對照組；順鉑+RD組小鼠血清VEGF、MMP-2水平低于順鉑組、RD組。提示順鉑聯(lián)合RD可降低血清MMP-2水平，降低腫瘤細胞侵襲和轉移能力，從而改善患者遠期預后，抑制腫瘤復發(fā)。

綜上所述，RD聯(lián)合順鉑治療小鼠肺腺癌能進一步抑制腫瘤生長，降低血清VEGF、MMP-2水平及腫瘤組織中HIF-1α、VASH、b-FGF的表達，值得臨床推廣應用。但本研究未對RD改善化療產(chǎn)生的毒副作用及小鼠體內(nèi)炎性因子變化進行探討，有待進一步研究。

作者貢獻：鄧日強進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張宏華、程江濤、劉清毅、謝斌、侯紅梅進行實驗實施、評估、資料收集；楊印樓進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

基金項目：廣東省韶關市衛(wèi)生局項目(Y15023)

【中圖分類號】R 734.2

【文獻標識碼】B

DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.07.015

(收稿日期：2016-04-07；修回日期：2016-07-19)

Curative Effect and Mechanism of Rhizome Dioscin Combined with Cisplatin in Treating Rats with Lung Adenocarcinoma

DENGRi-qiang，YANGYin-lou，ZHANGHong-hua，CHENGJiang-tao，LIUQing-yi，XIEBin，HOUHong-mei.

DepartmentofRespiratoryMedicine，thePeople′sHospitalofNorthGuangdong，Shaoguan512026，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the curative effect and mechanism of rhizome dioscin combined with cisplatin in treating rats with lung adenocarcinoma.MethodsIn December 2015，a total of 48 specific pathogen free male T739 mice were selected，after 4 days of inoculation of tumor cells，all of the mice were randomly divided into A group，B group，C group and D group，each of 12 mice.Mice of A group received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride injection，mice of B group received intraperitoneal injection of cisplatin after 5 days，12 days and 19 days of inoculation of tumor cells，mice of C group received intraperitoneal injection of rhizome dioscin after 4 days of inoculation of tumor cells，mice of D group received intraperitoneal injection of rhizome dioscin combined with cisplatin.All of the mice were killed after 31 days of inoculation of tumor cells，body mass，tumor volume，tumor weight，tumor inhibition rate，lung surface metastatic nodules number，serum levels of VEGF and MMP-2，expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues were compared among the four groups.ResultsBody mass and tumor weight of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group，tumor volume of B group，C group and D group was statistically significantly smaller than that of A group，respectively，and lung surface metastatic nodules number of B group，C group and D group was statistically significantly less than that of A group，respectively(P<0.05)；body mass and tumor weight of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group，respectively，tumor volume of D group was statistically significantly smaller than that of B group and C group，respectively，tumor inhibition rate of D group was statistically significantly higher than that of B group and C group，respectively，lung surface metastatic nodules number of D group was statistically significantly less than that of B group and C group，respectively(P<0.05).Serum levels of VEGF and MMP-2 of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05)；serum levels of VEGF and MMP-2 of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group(P<0.05).Expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues of B group，C group and D group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05)；expressions of HIF-1α，VASH and b-FGF in tumor tissues of D group were statistically significantly lower than those of B group and C group(P<0.05).ConclusionRhizome dioscin combined with cisplatin can effectively inhibit the tumor cell proliferation of lung adenocarcinoma in mice，reduce the serum levels of VEGF and MMP-2，down-regulated the expressions of HIF-1α，VASH，b-FGF in tumor tissues.

【Key words】Adenomatosis，pulmonary；Cisplatin；Rhizome dioscin；Integrated traditional Chinese and Western medicine therapy