趙穎　王澎　孫宏莉　楊啟文　王瑤　王賀　徐英春　趙玉沛

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730)

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非免疫抑制患者內源性土曲霉眼內炎1例及實驗研究

趙穎王澎孫宏莉楊啟文王瑤王賀徐英春趙玉沛

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730)

目的報道1例非免疫抑制患者內源性土曲霉眼內炎及實驗研究。方法采集本院收治的1例非免疫抑制內源性眼內炎患者的玻璃體液，進行直接涂片鏡檢、培養(yǎng)，并進一步對分離到的菌株進行表型分析，分子鑒定及E-test法體外抗真菌藥敏試驗。結果直接涂片鏡檢可見真菌孢子及有隔真菌絲，培養(yǎng)7 d后生長菌落較小，形態(tài)不典型，經分子鑒定及多次轉種觀察形態(tài)確定為土曲霉。E-test法測得MIC值 (μg/mL)：伊曲康唑0.250，伏立康唑0.125，兩性霉素B 2.000。結論 早期診斷性和治療性玻璃體切割術有利于獲得足夠的樣本用于微生物鑒定，并可以減少玻璃體中微生物量及炎性物質。直接涂片迅速報告鏡檢結果對臨床最初選擇抗菌藥物有重要意義。對于直接分離自臨床標本的形態(tài)不典型的絲狀真菌，采用ITS序列分析等分子生物學鑒定有助于盡早定種，縮短鑒定時間。

土曲霉；眼內炎；分子鑒定

[Chin J Mycol，2016，11(3):145-148]

曲霉菌是一種相對罕見的致病菌，其感染通常發(fā)生在惡性腫瘤、糖尿病等免疫抑制的患者。其中與疾病相關的常見菌種為煙曲霉和黃曲霉，土曲霉引起的感染相關少見，由土曲霉引起的眼內炎的相關報道更少[1]。本文報道1例土曲霉引起的真菌性眼內炎，該患者有高血壓病史，但之前未接受過眼內手術，無免疫抑制病史。

1　材料和方法

1.1臨床資料

患者老年男性，急性起病。出現(xiàn)頭痛、咳嗽、無流涕、發(fā)熱，6 d后右眼視力突然下降，伴有眼紅，無眼痛，無固定黑影遮擋，就診于外院，診斷為“右眼全葡萄膜炎 性質待查”，予以潑尼松龍50 mg，1次/d，逐漸減量，左氧氟沙星，阿昔洛韋，克拉霉素，鹽酸特比萘酚片口服，局部典必舒，更昔洛韋，泰利必妥滴眼液點眼，并球周結膜下各注射地塞米松3次，劑量不詳。自覺癥狀無好轉，為求進一步診治，發(fā)病1個月后就診于我院。起病以來，飲食、睡眠可，大小便正常，體重無明顯下降。無侵襲性診療操作史。發(fā)現(xiàn)高血壓5 a，最高收縮壓140 mmHg，目前口服藥物治療，血壓控制在正常范圍。無輸血史，無肝炎、結核等傳染病史。無藥物食物其他物質過敏史。無吸煙史，無飲酒史。入院查體：視力：右HM，光定位 (上--+中+++下+++)；左0.5；雙眼眼壓正常；雙眼淚道沖洗通暢，無膿、無分泌物溢出。右眼結膜混合性充血，右眼角膜透明，KP (+)，灰白塵狀，左眼角膜透明，KP (-)。右眼前房正常深淺，房閃 (+)，浮游體 (+++)，下方可見前房積膿，約1 mm。左眼前房正常深淺，房閃 (-)，浮游體 (-)。右眼玻璃體彌漫粟粒狀白色渾濁，下方可見一大棉團樣白色混濁，左眼玻璃體輕混濁。輔助檢查：眼B超提示雙眼玻璃體混濁。血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血、肝腎功能、CRP、血沉基本正常。心電圖：竇性心動過緩。感染：HIV (-)，HCV (-)，RPR (-)，HBsAg (-)。

1.2診斷、治療和標本采集

入院后為明確診斷行右眼玻璃體切割術+眼內注藥術，術中玻璃體腔內注射兩性霉素B 5 μg (0.1 mL)，結膜下注射阿米卡星0.1 mL+地塞米松5 mg，結膜囊內涂左氧氟沙星眼膏，術中見視網(wǎng)膜灰白，血管白線，抽取玻璃體標本送檢做微生物學檢查。術后口服氟康唑150 mg，1次/d，抗真菌治療 (患者因經濟條件限制未使用伏立康唑)。術后1 d查體，右眼視力0.02，眼壓19 mmHg，結膜下出血，KP (+)，灰白塵樣，房閃 (+)，浮游體 (+)，玻璃體輕度渾濁，眼底見視網(wǎng)膜在位，色灰白，血管周白線，下方周邊視網(wǎng)膜前可見白色點狀病灶。術后3 d眼底仍有少量病灶，局麻下再次行眼內兩性霉素B注藥術，玻璃體腔內注射兩性霉素B 5 μg (0.1 mL)。術后繼續(xù)口服氟康唑150 mg，1次/d，全身抗真菌治療，局部兩性霉素B點眼。第2次術后2 d右眼視力0.15，眼壓9 mmHg，結膜下出血較前吸收，KP (-)，房閃 (+)，浮游體 (+)，玻璃體輕度渾濁，眼底見視網(wǎng)膜在位，色灰白，血管周白線，下方周邊視網(wǎng)膜前可見白色點狀病灶，較前吸收好轉。術后5 d病情穩(wěn)定，予出院，繼續(xù)氟康唑抗真菌治療。門診隨診。

1.3實驗室研究

標本直接鏡檢及真菌培養(yǎng)將手術取材送檢玻璃體液標本接種血平板、中國藍平板、巧克力平板各1塊，35℃孵育，連續(xù)觀察菌落變化。同時直接涂片，革蘭染色鏡檢。

真菌藥敏試驗采用伊曲康唑、伏立康唑和兩性霉素B E-test抗真菌藥敏試條 (生物梅里埃，法國)對該菌進行體外抗真菌藥物敏感性試驗。菌株在土豆葡萄糖平板 (PDA)上35℃培養(yǎng)7 d至孢子成熟，挑取孢子用生理鹽水制備菌懸液 (0.5麥氏濁度)，用無菌拭子將菌懸液均勻涂布于RPMI 1640瓊脂平板上，置于生物安全柜約15 min，待表面干燥后，用無菌鑷子將E-test試條貼于平板上，35℃孵育，48 h后菌落生長較弱。繼續(xù)35℃孵育，72 h后讀取結果。

分子鑒定采用基因組DNA提取試劑盒 (QIAGEN，德國)提取DNA，用引物ITS1/ITS4[2]進行PCR擴增，送北京擎科生物技術有限公司進行純化測序，將核對好的序列在Genbank序列數(shù)據(jù)庫 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。

2　結　　果

2.1標本直接鏡檢及真菌培養(yǎng)

直接涂片革蘭染色鏡檢可見大量白細胞，未見細菌，可見真菌孢子及有隔真菌絲 (見圖1)，抗酸染色陰性，電話報告臨床，建議抗真菌治療。

標本接種后4 d后血平板和巧克力平板長出極小的絨毛樣菌落，將其點種沙氏瓊脂平皿 (SDA)與原始平板一起繼續(xù)35℃孵育。再孵育3 d (共7 d后)原始平板菌落較前略長大，但仍很小 (見圖2)。初次轉種SDA 10 d后，菌落形態(tài)仍不典型 (見圖3)，采用透明膠帶粘片鏡檢在菌絲旁找到附著孢子 (見圖4)，無其他典型結構，不能確定菌種。再次轉種SDA和察氏培養(yǎng)基35℃孵育10 d后，菌落形態(tài)較前典型 (見圖5)，鏡下找到產孢結構顯示曲霉頭和雙層瓶梗 (見圖6)。

2.2真菌藥敏試驗

E-test法72 h后讀取MIC值結果 (μg/mL)：伊曲康唑0.250，伏立康唑0.125，兩性霉素B 2.000 (見圖7)。

2.3分子鑒定

ITS區(qū)PCR擴增產物大小為700 bp左右 (見圖8)。核對好的序列在Genbank序列數(shù)據(jù)庫 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。根據(jù)BLAST的結果，待測菌株ITS序列和標準菌株土曲霉ATCC 12238 (JQ070071.1)一致性為100%，通過序列分析鑒定為土曲霉。

3　討　　論

土曲霉是一種常見的土壤腐生菌，可以從沙漠、草原、堆肥堆及被污染的存儲的玉米、大麥、花生中分離到。該菌也具有重要的臨床意義，可引起淺部真菌感染，如甲癬，在嚴重免疫功能抑制患者也可引起侵襲性曲霉病。以往的研究顯示，土曲霉常常會引起播散性感染，相比于曲霉菌屬中的其他菌種而言其導致的死亡率更高[3]。土曲霉眼內炎通常發(fā)生在靜脈注射吸毒、血液系統(tǒng)惡性腫瘤等免疫抑制或者眼科手術后的患者中。土曲霉眼內炎的癥狀與其他曲霉菌引起眼內炎的癥狀是相似的，患者通常會出現(xiàn)單側輕度眼部不適，持續(xù)數(shù)天的漸進的視力下降。可能會發(fā)生嚴重的前葡萄膜炎，需要結膜下注射。眼后段發(fā)現(xiàn)常顯示中到重度的玻璃體棉絮狀團塊、淡黃色滲出性累及血管的視網(wǎng)膜病變，伴有視網(wǎng)膜前和視網(wǎng)膜內出血，血管閉鎖視網(wǎng)膜缺血，也有假前房積膿、滲出、視網(wǎng)膜脫落的報道。常常診斷困難或診斷延遲[1]。全身使用及玻璃體腔內注射兩性霉素B一直是內源性曲霉菌眼內炎的標準治療方案[1,4-5]。但以往研究表明土曲霉對兩性霉素B的耐藥性可達98%。伊曲康唑和伏立康唑可作為替代的全身抗真菌治療藥物[1,6]。

圖1玻璃體液涂片革蘭染色可見有隔真菌絲 (×1 000)圖2玻璃體液標本接種血平皿35℃孵育7 d后菌落形態(tài)圖3初次點種SDA 35℃孵育3 d (a)和10 d (b)后菌落形態(tài)圖4初次點種SDA 35℃孵育10 d后菌落直接粘片后鏡檢 (a.×400,b.×1 000)菌絲及附著孢子圖5再次點種SDA 35℃孵育10 d后菌落形態(tài) (a.正面,b.背面)；察氏平皿35℃孵育10 d后菌落形態(tài) (c.正面,d.背面)圖6 再次點種SDA 35℃孵育10 d后菌落透明膠帶粘片乳酸酚棉蘭染色鏡檢 (×400)圖7E-test法體外抗真菌藥物敏感性試驗結果 (72 h)，MICs (μg/mL)：IT伊曲康唑0.250，AP兩性霉素B 2.000，VO伏立康唑0.125圖8ITS序列擴增產物凝膠電泳圖

Fig.1Septate hyphae found in direct smear of vitreous fluid by Gram stain (×1 000)Fig.2Initial colonies grew on blood agar after 7 days at 35℃Fig.3 Colonies on SDA after 3 days (a) and 7 days (b) at 35℃Fig.4Solitary lateral one-cell conidia formed on submerged hyphae after 10 days at 35℃ (a.×400,b.×1 000)Fig.5Third generation colonies on SDA (a.front,b.back) and Czapek-Dox Medium (c.front,d.back) after 10 days at 35℃Fig.6 Lactophenol cotton blue mount of third generation colonies on SDA after 10 days at 35℃ (×400) Fig.7Invitroantifungal drug sensitivity test results by E-test method (72 h).MIC values (μg/mL):IT,itraconazole 0.250,AP,amphotericin B 2.000,VO,voriconazole 0.125Fig.8Gel electrophoresis showed ITS PCR product

本文報道1例由土曲霉引起的眼內炎，患者以往無眼外傷，手術或可以解釋現(xiàn)狀的病史，感染的確切來源無法確定。該患者在外院診斷為葡萄膜炎，曾采用激素和抗菌藥物等治療1個月，入我院時，臨床醫(yī)生根據(jù)病史、查體及輔助檢查，其癥狀尤其是出現(xiàn)玻璃體團塊狀改變，懷疑真菌性眼內炎的可能性大，行診斷性玻璃體切割術，術中取得玻璃體標本迅速送微生物檢驗，涂片見真菌孢子及有隔真菌絲，立即回報臨床，臨床立即針對性眼內注射兩性霉素B?；颊甙Y狀在術后有所改善。感染科醫(yī)生會診建議使用針對絲狀真菌的伏立康唑或伊曲康唑進行全身抗真菌治療藥物，但因患者經濟條件限制，術后僅口服氟康唑全身抗真菌治療。以往研究顯示曲霉菌對口服氟康唑耐藥[7]，術后用氟康唑全身抗真菌治療并不是一個好的選擇，不推薦采用。因本例患者玻璃體切割術中切除了感染部分玻璃體同時將其中的大部分病原體也去除，且術中采用兩性霉素B玻璃體腔內注射，局部藥物濃度高，起到一定的抗真菌作用。患者居住在外地，未遵醫(yī)囑來本院門診隨診，術后3個月電話隨訪患者自覺視力恢復尚可，可讀書、看手機、玩電腦游戲。

該病例里分離到的土曲霉在一開始接種時，生長緩慢，7 d后菌落仍很小。在初次轉種SDA 10 d后，菌落和鏡下形態(tài)不能確定菌種，再次轉種SDA 10 d后，菌落形態(tài)較前典型，鏡下找到產孢結構顯示曲霉頭和雙層瓶梗。這種形態(tài)不典型的絲狀真菌，僅靠形態(tài)學鑒定較困難且耗時較長。而分子鑒定技術，用最初長出的小菌落提取菌株DNA，采用ITS序列分析鑒定為土曲霉，鑒定時間大大縮短。即便如此，我們得到鑒定結果的時候，患者已出院。

值得強調的是眼科和微生物實驗室密切配合是有效治療和保存視力的基本保證。診斷性玻璃體切割術和玻璃體腔內注射抗真菌藥物需要由有治療真菌性眼內炎經驗的眼科醫(yī)生進行。局部藥物吸收、藥物之間相互作用及與唑類藥物共同運用時的毒性需要有經驗的感染科醫(yī)生指導。認真跟進評估對治療的反應，檢測黃斑或玻璃體病變進展，并盡早啟動維持視力的治療是必不可少的[8]。

綜上所述，對于未采用規(guī)范的抗菌藥物治療或類固醇治療的后葡萄膜炎應高度懷疑真菌性眼內炎。早期診斷性和治療性玻璃體切割術有利于獲得足夠的樣本用于微生物鑒定，并且可以減少玻璃體中微生物量及炎性物質。從微生物實驗室檢驗的角度，直接涂片迅速報告臨床鏡下結果對臨床最初選擇抗菌藥物有很重要的意義。另外，在遇到此類從臨床標本直接接種后生長較緩慢，最初菌落形態(tài)和鏡下形態(tài)均不太典型的絲狀真菌，采用ITS序列分析等分子生物學鑒定的方法有助于盡早鑒定出菌名，提高鑒定速度。

[1]Ng J,Ho S,Krishnan P,et al.Aspergillusterreusendogenous endophthalmitis in a nonimmunocompromised patient with a history of bronchiectasis[J].Ocul Immunol Inflamm,2013,21(3):231-233.

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A rare case ofAspergillusterreusendogenous endophthalmitis in a nonimmunocompromised patient and laboratory research

ZHAO Ying,WANG Peng,SUN Hong-li,YANG Qi-wen,WANG Yao,WANG He,XU Ying-chun,ZHAO Yu-pei

(Desect1mentofClinicalLaboratory,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

ObjectiveTo report a rare case ofAspergillusterreusendogenous endophthalmitis in a nonimmunocompromised patient and laboratory research.MethodsA vitreous biopsy was taken for culture and direct smear microscopy，and further identified the isolate from culture positive plates by phenotype observation and molecular methods.Invitroantifungal susceptibility test was done by E-test method.ResultsFungal spores and septate hyphae were found in vitreous direct smear.Tiny hair like colonies growed after 7 days in culture.The isolate was final identified asAspergillusterreusaccording to morphology of the fungus and the results of phenotypic and molecular identification.The isolate's MICs (μg/mL) to itraconazole,voriconazole,amphotericin B were 0.25,0.125,2,respectively.ConclusionEarly diagnostic and therapeutic vitrectomy was useful to obtaining sufficient samples for organism identification and also to reduce organism load and inflammatory mediators in the eye.Reporting the direct smear results timely to clinical physician is very meaningful for the initial selection of antimicrobial agents.For the clinical isolated filamentous fungi with atypical phenotype,ITS sequence analysis and other molecular methods can help to identify the fungal pathogen promptly.

Aspergillusterreus；endophthalmitis；molecular identification

2015-07-29[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項 (201402001)

趙穎，女 (漢族)，碩士，助理研究員.E-mail:zhaoying28062806@163.com

徐英春,E-mail:xycpumch@139.com

R 519.8

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1673-3827(2016)11-0145-04