張　萌，邊志剛，何　平*

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葫蘆素B 通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)人肺癌NCI-H460 細(xì)胞凋亡

張萌a，邊志剛b，何平a*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 a.干診科，b.鼻科，沈陽 110004

[摘要]目的探討葫蘆素B 對人肺癌NCI-H460 細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)NCI-H460 細(xì)胞，MTT 法觀察葫蘆素B 對細(xì)胞增殖的影響，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。采用羅丹明123(Rhodamine 123)染色，通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位(△ψm)，采用Western blot 方法檢測線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素C。結(jié)果葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈劑量、時間依賴性；葫蘆素B 處理組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞皺縮、變圓，可見胞核染色質(zhì)濃縮；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示葫蘆素B 誘導(dǎo)NCI-H460 細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性。葫蘆素B 處理后線粒體膜電位顯著下降，細(xì)胞色素C 由線粒體釋放到胞漿中。結(jié)論葫蘆素B 可以抑制人肺癌NCI-H460 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，線粒體途徑參與葫蘆素B 誘導(dǎo)的NCI-H460 細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]葫蘆素B；肺癌；凋亡；線粒體途徑

0　引言

肺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的健康和生命。我國肺癌發(fā)病率已經(jīng)位居惡性腫瘤發(fā)病率的首位。探明肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療手段，是亟待解決的難題和挑戰(zhàn)。

隨著多藥耐藥的提出，在全世界范圍內(nèi)，抗癌藥物的研究已逐漸轉(zhuǎn)向天然動物和植物，我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥越來越受到人們的青睞，單味中藥及其有效成分或復(fù)方制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究已成為近年來腫瘤研究的一個熱點(diǎn)。葫蘆素B (Cucurbitacin B，CuB )是從葫蘆科等植物中分離得到的一類四環(huán)三萜類化合物，是葫蘆素家族中含量最豐富的成員。在上世紀(jì)70～80 年代，我國就已研發(fā)出葫蘆素片(主要成分為葫蘆素B 和葫蘆素E)，作為原發(fā)性肝癌和肝炎的輔助治療藥物[1]。近年來，大量的研究表明，小劑量的葫蘆素B對喉癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞的生長也具有抑制作用[2-11]，但具體機(jī)制尚存在爭議，有待進(jìn)一步研究。本研究就葫蘆素B 對人肺癌細(xì)胞系NCI-H460 細(xì)胞株的影響及可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討，以期為肺癌的治療提供新的藥物和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑人肺癌NCI-H460 細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈；葫蘆素B 購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清購自天津?yàn)笊锕?；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自 GIBCO 公司；0.25% 胰蛋白酶購自以色列 Biological Industries 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)及羅丹明123 購自美國 Sigma 公司；Annexin V/PI 雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；線粒體/胞漿蛋白提取試劑購自 BioVision 公司；BCA 法蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin、細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)抗體購自 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自武漢博士德生物工程公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購自 Thermo Scientific Pierce 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，在37 ℃、飽和濕度、二氧化碳濃度為5% 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。NCI-H460 細(xì)胞呈單層貼壁生長，每2～3 天傳代1 次。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT 法檢測細(xì)胞增殖將消化收集好的NCI-H460 細(xì)胞調(diào)整成濃度為1×105/mL 的細(xì)胞懸液，100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜貼壁后，依次加入含不同濃度葫蘆素B 的培養(yǎng)液，使其終濃度分別為0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μmol/L，同時設(shè)空白對照組和陰性對照組，每組設(shè)3 個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 或72 h。每孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min。酶標(biāo)儀(波長570 nm) 檢測每孔光密度值(OD值)。增殖抑制率按如下公式計算：抑制率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)將對數(shù)生長期細(xì)胞分別加入含0.5、5 μmol/L 葫蘆素B 的培養(yǎng)液，對照組加相同容積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率將NCI-H460 細(xì)胞5×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，過夜待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度葫蘆素B 的培養(yǎng)液，使其濃度分別為0.5、5 μmol/L，并設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化，收集細(xì)胞后，用500 μL 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，AnnexinV-FITC、PI 雙染細(xì)胞，室溫避光孵育15 min后上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6線粒體膜電位的檢測將NCI-H460 細(xì)胞5×105個/孔接種于6 孔培養(yǎng)板中過夜，加入終濃度為0.5、5 μmol/L的葫蘆素B 溶液，并設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640 培養(yǎng)基)和陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將上清和消化下來的細(xì)胞收集到15 mL的離心管中，2 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS) 再洗滌1次并相同條件離心。棄上清，用1 mL PBS重懸細(xì)胞，加入羅丹明123 染液5 μL(濃度為10 mg/mL)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min。PBS離心洗滌細(xì)胞2 次(2 000 轉(zhuǎn)/min，10 min)，棄上清，1 mL PBS 重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析。用ModFit 專業(yè)軟件獲取分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7Western blot 檢測葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞Cyt C 表達(dá)的影響將對數(shù)生長期的NCI-H460 細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，生長24 h后加入含0.5、5 μmol/L 葫蘆素B 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加等量RPMI-1640 培養(yǎng)基作為陰性對照。裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞漿和線粒體中的細(xì)胞蛋白，測定并調(diào)整蛋白濃度。樣品與2 倍濃度的上樣緩沖液以1∶1 的體積比混合，95 ℃ 變性5 min，室溫冷卻后40 μg/孔上樣，行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉(TBST 配制)室溫封閉1 h，洗膜后加入1∶500 稀釋的一抗(Cytochrome C、β-actin)，4 ℃ 孵育過夜，洗膜后加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，UVI凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)情況。

2　結(jié)果

2.1葫蘆素B 抑制NCI-H460 細(xì)胞增殖MTT 檢測結(jié)果顯示，葫蘆素B 使NCI-H460 細(xì)胞的增殖水平明顯受到抑制。隨著藥物濃度的增大及作用時間的延長，葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，表明葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。不同劑量組之間、不同時間組之間及其與對照組之間均有顯著性差異(P<0.05)，見圖1。

圖1　葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞的增殖抑制作用(MTT法)

2.2葫蘆素B 誘導(dǎo)NCI-H460 細(xì)胞形態(tài)改變在倒置相差顯微鏡下觀察，對照組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度明顯增大，形成致密貼壁的卵圓形或多角形細(xì)胞。細(xì)胞伸展性好，細(xì)胞質(zhì)均勻，核大、核仁清楚。葫蘆素B 作用后的NCI-H460 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，經(jīng)0.5 μmol/L 葫蘆素B 作用24 h的細(xì)胞，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞皺縮、變圓，胞核染色質(zhì)濃縮。經(jīng)5 μmol/L 葫蘆素B 處理24 h的細(xì)胞全部皺縮變圓，大量細(xì)胞脫落、死亡，漂浮于培養(yǎng)液中，見圖2。

圖2　倒置相差顯微鏡觀察NCI-H460 細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Annexin V/PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，0.5、5 μmol/L的葫蘆素B 可以誘導(dǎo)NCI-H460 細(xì)胞凋亡，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著藥物濃度的增大，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞都逐漸增多，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，見圖3。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測CuB 對NCI-H460 細(xì)胞凋亡的影響

2.4葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞線粒體膜電位△ψm 的影響0.5、5 μmol/L 葫蘆素B 處理NCI-H460 細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的線粒體膜電位△ψm 峰值下降，△ψm 峰出現(xiàn)有意義的向左移的趨勢，分布在去極化區(qū)域的細(xì)胞增多，由對照組的(3.18±0.98)%升高到(15.18±1.45)%和(30.32±1.62)%，不同濃度組與對照組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4　葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞線粒體膜電位的影晌

2.5葫蘆素B對NCI-H460 細(xì)胞Cyt C釋放的影響Western blot 方法檢測胞漿內(nèi)及線粒體內(nèi)的Cyt C，發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 作用于NCI-H460 細(xì)胞后，胞漿內(nèi)Cyt C 逐漸增多，而線粒體內(nèi)Cyt C 逐漸減少，表明Cyt C 由線粒體釋放到胞漿中，隨葫蘆素B 作用濃度的增加，變化更明顯，見圖5。

圖5　葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞Cyt C 釋放的影響

3　討論

葫蘆素B 是提取自葫蘆科及多種其他科屬植物的葫蘆素成分之一，具有多種生物活性，近年來的研究表明，葫蘆素B 能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，其抗腫瘤作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本研究用不同濃度的葫蘆素B 處理人肺癌NCI-H460 細(xì)胞一定時間后，用MTT 比色法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，葫蘆素B 對NCI-H460 細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，其作用呈劑量和時間依賴性(圖1)。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明，葫蘆素B 處理使細(xì)胞密度降低，細(xì)胞皺縮、變圓，胞核染色質(zhì)濃縮，部分細(xì)胞脫落、死亡，漂浮于培養(yǎng)液中(圖2)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B 作用于NCI-H460 細(xì)胞一定時間后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，隨著葫蘆B 濃度的增加，細(xì)胞凋亡率亦增加(圖3)。這些結(jié)果均提示，葫蘆素B 作用于肺癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，加之細(xì)胞凋亡增加，腫瘤生長受到抑制。

一般認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞異常增殖和分化的結(jié)果，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)，是細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到抑制，機(jī)體不能及時清除體內(nèi)過多的、受損傷的或惡變的細(xì)胞的結(jié)果。研究表明，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著中心調(diào)控的重要作用，線粒體功能的障礙可導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞出現(xiàn)衰老和凋亡，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[12-16]。保護(hù)線粒體功能的完好可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。大量證據(jù)表明，凋亡細(xì)胞在產(chǎn)生特征性的形態(tài)學(xué)變化和DNA 降解之前，線粒體的形態(tài)和功能就已經(jīng)發(fā)生了變化，線粒體跨膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件。當(dāng)?shù)蛲龀绦虻拈_始信號到達(dá)線粒體后，線粒體膜腫脹，膜通透性增高，導(dǎo)致線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子和離子的不對稱分布消失，從而導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體功能紊亂，Cyt C 等各種促凋亡蛋白被釋放到胞漿中。當(dāng)Cyt C 與凋亡蛋白激活因子1 相結(jié)合后，募集并激活Caspase-9，再促使下游的凋亡效應(yīng)因子Caspase-3 等活化，最終觸發(fā)Caspase 介導(dǎo)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)[18]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

我們檢測了葫蘆素B 作用后NCI-H460 細(xì)胞線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用劑量的增加，線粒體膜電位水平△ψm 峰值下降，△ψm 峰出現(xiàn)有意義的向左移的趨勢。Cyt C 的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著葫蘆素B 藥物濃度的增加，線粒體內(nèi)Cyt C 減少，而胞漿內(nèi)Cyt C 逐漸增多，即Cyt C 從線粒體釋放入胞漿中。表明葫蘆素B可能通過導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的下降，使線粒體內(nèi)Cyt C 釋放到胞漿中，進(jìn)而引起Caspase 激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。葫蘆素B 通過激活細(xì)胞凋亡的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是其抗腫瘤作用的一個重要機(jī)制。

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收稿日期：2015-12-20

基金項(xiàng)目：盛京醫(yī)院院內(nèi)課題(MD55)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603002

Cucurbitacin B induces apoptosis of NCI-H460 lung cancer cells through activation of mitochondrial pathway

ZHANG Menga,BIAN Zhi-gangb,HE Pinga*

(a.Desect1ment of Geriatrics Medicine,b.Desect1ment of Rhinology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of Cucurbitacin B on the proliferation and apoptosis of NCI-H460 lung cancer cells and investigate the mechanism.MethodsThe NCI-H460 cells were cultured in vitro.The growth inhibitory effect of Cucurbitacin B on NCI-H460 cells was detected by MTT assay.The morphological changes were observed under inverted microscope.Apoptosis rate was determined by flow cytometry analysis.The mitochondrial membrane potential (Δψm) was detected by flow cytometry following rhodamine 123 staining.The expression of mitochondrial cytochrome C and cystolic cytochrome C was determined by Western blot.ResultsThe growth of NCI-H460 cells was inhibited by Cucurbitacin B in a dose-and time-dependent manner.Marked morphological changes such as cell volume shrinking and chromatin condensation were observed after treatment by Cucurbitacin B.Flow cytometry analysis showed that Cucurbitacin B could induce NCI-H460 cells apoptosis in a dose-dependent manner.Cucurbitacin B treatment induced significant disruption of △ψm.Cytochrome C was released from mitochondria to cytoplasm.ConclusionCucurbitacin B could inhibit the growth of NCI-H460 lung cancer cells and induce cell apoptosis through activation of mitochondrial pathway.

Key words：Cucurbitacin B；Lung cancer；Apoptosis；Mitochondrial pathway