郭玉卿　王麗娜　劉　璠　楊愛格　董閃閃　康　巖　張趁茹　周慧敏

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北　石家莊　050030)

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PI3K在2型糖尿病模型大鼠骨質(zhì)疏松中的作用及LY294002的干預(yù)效果

郭玉卿王麗娜劉璠楊愛格董閃閃康巖張趁茹周慧敏

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050030)

目的探討PI3K在2型糖尿病(T2DM)骨質(zhì)疏松(OP)中的作用及LY294002的干預(yù)效果。方法選擇75只清潔級近交雌性Wistar 大鼠，隨機分為假手術(shù)組(NS組)，T2DM OP模型組(M組)和LY294002干預(yù)組(IN組)。M組和IN組大鼠均采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備T2DM大鼠模型，兩組大鼠均采用手術(shù)摘除卵巢的方式制作OP大鼠模型。IN組在模型制作成功后注射溶解于二甲基亞砜(DMSO)的LYP294002。采用SABC免疫組化法檢測PI3K、AKT-1、AKT-2在骨骼肌中的表達情況。結(jié)果M組大鼠PI3K表達水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組顯著低于NS組(P<0.05)，M組顯著高于IN組(P<0.05)；M組大鼠AKT-1表達水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組顯著低于NS組(P<0.05)，M組顯著高于IN組(P<0.05)；M組大鼠AKT-2表達水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組顯著低于NS組和M組(P<0.05)。結(jié)論PI3K/AKT信號通路在T2DM大鼠OP大骨骼肌的活性降低，LY294002會進一步降低T2DM大鼠OP大骨骼肌PI3K/AKT信號通路的活性。

2型糖尿?。还琴|(zhì)疏松；PI3K；LY294002

研究表明糖尿病和骨質(zhì)疏松直接存在一定的相關(guān)性〔1〕，2型糖尿病(T2DM)由于體內(nèi)胰島素水平不同，對骨量的影響尚不明確。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路是重要的胰島素信號通路之一，是胰島素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要傳導(dǎo)通路，在骨骼肌、肝臟以及脂肪細胞均有分布〔2〕。也有研究認為PI3K、AKT是骨代謝的主要調(diào)節(jié)因子，能夠促進成骨細胞前體向成熟成骨細胞分化，促進骨形成。但關(guān)于PI3K在T2DM OP形成過程中的作用尚不明確。此外，LY294002為一種能夠阻斷細胞信號傳導(dǎo)通路的蛋白激酶抑制劑，能夠抑制PI3K/AKT信號途徑的傳導(dǎo)〔3〕。本研究旨在探討PI3K在T2DM OP中的作用及LY294002的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑PI3K兔抗鼠多克隆抗體INS、AKT-1兔抗鼠多克隆抗體、AKT-2兔抗鼠多克隆抗體一抗，武漢博士德生物技術(shù)有限公司；S-P檢驗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素、分化液、反藍液、中性樹膠、磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸緩沖液、多聚賴氨酸防脫玻片，河北博海生物工程開發(fā)有限公司；LY294002〔易萊生物科技(中國)有限公司〕，鏈脲佐菌素(STZ，上海前塵生物科技有限公司)。

1.2動物模型制備選擇75只清潔級近交雌性Wistar 大鼠，體重180～200 g，鼠齡2.5～3個月。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為假手術(shù)組(NS組)，T2DM OP模型組(M組)和LY294002干預(yù)組(IN組)。M組和IN組大鼠均采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射制備T2DM大鼠模型，T2DM模型制作成功后，兩組大鼠均采用手術(shù)摘除卵巢的方式制作OP大鼠模型。IN組在模型制作成功后注射溶解于二甲基亞砜(DMSO)的LYP294002。

1.3標本制備三組大鼠分組造模成功后第4、8、12周隨機選取5只處死，取右側(cè)股四頭肌，切成約5 mm×5 mm×5 mm，之后經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化監(jiān)測。

1.4骨骼肌免疫組化檢測采用SABC免疫組化法檢測PI3K、AKT-1、AKT-2在骨骼肌中的表達情況：(1)切片，將蠟塊標本放入2℃～8℃冰箱中靜置1 h，取出3 μm厚度的連續(xù)切片，粘貼到黏合劑多聚賴氨酸處理過的載玻片上，并將切片置于60℃恒溫烤箱中放置3 h備用。(2)脫蠟，切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，每步20 min。(3)脫苯，切片在梯度酒精中脫苯，酒精梯度設(shè)置為100%，100%，95%，90%，80%和70%共6步，每步3 min，脫苯完成后將切片取出，用PBS清洗2次，每次3 min。(4)3%過氧化氫滅活，用蒸餾水配置3%過氧化氫，室溫30 min滅活內(nèi)源性酶，PBS清洗2次，每次3 min。(5)封閉，切片在濕盒中，滴加正常山羊血清在室溫下封閉20 min。(6)一抗工作液配置，使用蒸餾水配置一抗工作液，濃度分別為PI3K 1∶150；AKT-1 1∶100；AKT-2 1∶100。(7)滴加一抗，濾紙吸干切片上正常的山羊血清后滴加配置好的一抗工作液，將濕盒放入4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；1 d后拿出濕盒，室溫放置恢復(fù)室溫，用PBS清洗除去一抗。(8)滴加二抗，從PBS中取出切片，擦干組織周圍的液體，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG(二抗)，37℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育30 min，PBS清洗。(9)滴加辣根霉標記卵白素工作液。(10)DAB顯色，復(fù)染和脫水。(11)透明化處理和封片后置于顯微鏡下觀察。

1.5免疫組化結(jié)果判斷PI3K、AKT-1、AKT-2均以在骨骼肌細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。每張切片均在顯微鏡下選擇5個高倍視野(×400)，應(yīng)用IPP多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)從陽性細胞百分比及染色強弱進行評價。a為陽性細胞百分比，無陽性細胞為0，陽性細胞1%～10%為1，11%～50%為2，51%～80%為3，81%～100%為4；b為陽性細胞染色強弱，陰性為0，弱陽性為1，中度陽性為2，強陽性為3。a、b兩項的乘積為該標本的免疫組化評分。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1三組大鼠PI3K表達水平比較在卵巢去除后第4周時，M組大鼠PI3K表達水平(4.6±0.8)顯著低于NS組(8.1±0.4)(t=19.566，P<0.05)，IN組(3.4±1.1)顯著低于NS組(t=6.617，P<0.05)，M組顯著高于IN組(t=7.262，P<0.05)；去卵巢后第8周時，M組大鼠PI3K表達水平(3.5±0.5)顯著低于NS組(6.5±0.7，P<0.05)，IN組(2.7±0.9)顯著低于NS組和M組(t=6.139，7.770；P<0.05)；去卵巢后第12周時，M組大鼠PI3K表達水平(3.4±0.6)顯著低于NS組(6.4±0.8，t=15.000，P<0.05)，IN組(2.3±0.6)顯著低于NS組和M組(t=5.501,11.196；P<0.05)。

2.2三組大鼠AKT-1、AKT-2表達水平比較在卵巢去除后第4周時，M組大鼠AKT-1、AKT-2表達水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組均顯著低于NS組(P<0.05)，M組大鼠AKT-1水平顯著高于IN組(P<0.05)，而AKT-2水平比較無顯著差異(P>0.05)；去卵巢后第8周時，M組大鼠AKT-1、AKT-2表達水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組顯著低于NS組和M組(P<0.05)；去卵巢后第12周時，M組大鼠AKT-1、AKT-2水平顯著低于NS組(P<0.05)，IN組水平顯著低于NS組和M組(P<0.05)。見表1。

表1　三組大鼠AKT-1、AKT-2表達水平比較

與NS組比較：1)P<0.05;與M組比較：2)P<0.05

3　討　論

糖尿病是由遺傳易感因素、免疫功能紊亂、精神因素等多種致病因子共同作用下引起的一種代謝綜合征，以胰島素含量絕對或相對不足為主要特點。目前糖尿病在我國具有較高的發(fā)病率，約為9.7%，且這一發(fā)病率近年來受多種因素影響呈現(xiàn)不斷遞增的趨勢〔4〕。1型糖尿病由于胰島素含量的絕對缺失造成骨量降低是確切的，但T2DM與OP的關(guān)系尚未得到確定。

本研究之所以選擇骨骼肌作為本次組織研究的對象，主要是由于骨骼肌是胰島素刺激葡萄糖攝取的主要靶組織，同時是胰島素抵抗發(fā)生的主要場所。本研究表明肌肉的運動能夠抑制肝糖輸出，緩解機體胰島素抵抗。而且骨骼肌通過收縮產(chǎn)生的肌力以及通過骨應(yīng)變調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞功能代謝影響了骨細胞的代謝〔5〕。總之，骨骼肌與OP存在密切關(guān)系，而同時也是血糖調(diào)節(jié)發(fā)生的主要場所，是細胞增殖、轉(zhuǎn)移、黏附和死亡過程的重要調(diào)節(jié)者。盡管其是一種重要的胰島素信號調(diào)節(jié)通路，但其同時與骨組織形成有著密切關(guān)系，如能夠促進堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)等成骨分化標志物的表達，促進骨量的增加〔6〕。同時，PI3K/AKT信號通路能夠參與調(diào)控破骨細胞分化、存活和骨吸收，通過抑制PI3K/AKT信號通路活性能夠使破骨細胞吸收能量減弱而增加骨量，緩解OP〔7〕。

本研究結(jié)果說明T2DM OP大鼠PI3K/AKT信號通路受到抑制，使機體成骨量減少而發(fā)生了OP。從趨勢上看M組大鼠在第8周時與第4周相比存在上升或降低不顯著的現(xiàn)象，這可能是由于機體自身存在的某種恢復(fù)機制，代償性的有潛在增強PI3K/AKT信號通路活性的作用，但這種作用并不持久。由于PI3K/AKT信號通路的雙向調(diào)節(jié)功能，通過抑制其活性，可降低破骨細胞骨吸收功能活性，對破骨細胞骨吸收功能的抑制也是防治OP的主要藥理基礎(chǔ)?？傊?，PI3K/AKT信號通路在T2DM大鼠OP大骨骼肌的活性降低，LY294002會進一步降低T2DM大鼠骨OP大骨骼肌PI3K/AKT信號通路的活性。但關(guān)于LY294002對OP癥的最終影響結(jié)果尚需進一步的研究證實。

1尹嘉晶,彭永德.糖尿病與骨質(zhì)疏松〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2014;30(5):449-52.

2劉中天,尚靖.骨代謝分子信號通路研究進展〔J〕.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2012;8(6):222-4.

3Chun GX,Zhu BS,Fan XQ,etal.Effects of LY294002 on the invasiveness of human gastric cancer in vivo in nude mice〔J〕.World J Gastr,2009;15(40):5044-52.

4郝改鳳,王團娥.糖尿病發(fā)病率相關(guān)因素調(diào)查分析及護理干預(yù)〔J〕.齊魯護理雜志,2014;21(1):37-8.

5Hoeks J,de Wilde J,Hulshof MF,etal.High fat diet-induced changes in mouse muscle mitochondrial phospholipids do not impair mitochondrial respiration despite insulin resistance〔J〕.PLoS One,2011;6(11):e27274.

6Wu CM,Chen PC,Li TM,etal.Si-Wu-tang extract stimulates bone formation through PI3K/AKT/NF-kappaB signaling pathways in osteoblasts〔J〕.BMC Complement Altern Med,2013;13:277.

7Adapala NS,Brebe MF,Tsygankov AY,etal.Loss of Cbl-PI3K interaction enhances osteoclast survival due to p21-Ras medicated PI3K activation independent of Cbl-b〔J〕.J Cell Biochem,2014;115(7):1277-89.

〔2015-12-22修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.012

河北省衛(wèi)生廳項目(20130264)

周慧敏(1966-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事糖尿病研究。

郭玉卿(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病與骨質(zhì)疏松研究。

R589

A

1005-9202(2016)14-3377-03；