林　浥，俞　瀅，陳　丹，陳　靜，姚雪倩，陳桂信，葉乃興（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福州茉莉花茶科技與全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)聯(lián)合研究中心，福建福州 350002）

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白蘭花萜類合成酶基因McHMGR保守區(qū)的克隆及其表達(dá)分析

林浥，俞瀅，陳丹，陳靜，姚雪倩，陳桂信，葉乃興*
（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福州茉莉花茶科技與全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)聯(lián)合研究中心，福建福州 350002）

以白蘭（Michelia alba DC.）花瓣為材料，采用RT-PCR方法，克隆得到白蘭花萜類代謝途徑中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（McHMGR）的保守區(qū)，該cDNA保守區(qū)長為421bp，編碼128個氨基酸。序列分析結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與同屬植物樂昌含笑的HMGR具有99%的同源性。采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測McHMGR在白蘭開花過程中四個時期的的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，表達(dá)量在盛花期最高，花芽期最低。

白蘭；香氣；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；實(shí)時熒光定量PCR

白蘭（Michelia alba DC.）屬木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Miche原lia L.）常綠喬木，別稱白玉蘭、白蘭花、白緬花、緬桂花，其花香濃郁持久。白蘭花是茶用香花，可用于窨制白蘭花茶，也可以作為配料加工茉莉花茶，以加重底香、增強(qiáng)鮮靈度［1］。前人已對白蘭花香氣成分進(jìn)行了研究，表明白蘭花揮發(fā)性成分中含量較高的有芳樟醇、甲基異丁子香酚、順-羅勒烯、9，12，15-三烯十八醇、亞油酸甲醋、苯乙醇等化合物［2］，其中主要為萜類物質(zhì)，目前已從白蘭花中共鑒定出31種萜類化合物［3］。白蘭花具有止咳、化濁等藥理功能，這可能與芳樟醇抗菌等功能有關(guān)［4］。萜類代謝途徑包括甲羥戊酸途徑（MVA）和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（MEP）。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是甲羥戊酸途徑中第一個限速酶，對于白蘭花香氣物質(zhì)的形成具有重要的作用［5］。已在巴西橡膠、馬鈴薯、鐵皮石斛、茶樹、茉莉花等植物中分離得到HMGR基因［6-10］。

目前從分子生物學(xué)角度對白蘭花香氣形成機(jī)理的研究尚未見報道，本研究采用RT-PCR技術(shù)成功克隆得到白蘭花香氣形成的萜類代謝途徑上HMGR基因的保守區(qū)序列，命名為McHMGR，并采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析McHMGR在白蘭花不同開放時期的相對表達(dá)量變化。擬通過本研究，為McHMGR基因全長cDNA的獲得及其功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，闡明白蘭花香氣形成的分子機(jī)制，以期為生產(chǎn)上白蘭花茶的窨制和白蘭花打底窨制茉莉花茶時間的合理運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)以白蘭花花瓣為供試材料，取自福建農(nóng)林大學(xué)主干道旁白蘭樹。于2015年7月下旬起，根據(jù)花被片張開程度將分4個發(fā)育時期（花芽期：花蕾綠色，苞片未張開；大花蕾期：花蕾白色，苞片已脫落，花瓣與花柱夾角呈0°；初花期：花被片微微張開，花瓣與花柱夾角呈30°；盛花期：白蘭花全面盛開，花瓣與花柱夾角呈90°，花被片遇觸碰脫落）采摘花瓣，稱取0.1g，用錫箔紙包裹后放入液氮速凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2白蘭花花瓣總RNA的提取

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取白蘭花總RNA，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.3McHMGR保守區(qū)的克隆

參照鄭鴻昌［11］合成和純化cDNA第一鏈。從GenBank下載已登錄的不同植物的HMGR基因序列，根據(jù)已報道的人參（Panax ginseng）、荔枝（Litchi chinensis）、茉莉花（Jasminum sambac（L.）Ait）等植物的HMGR基因序列，使用primer primer5軟件根據(jù)比對序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物McHMGR-F、McHMGR-R（表1）。PCR擴(kuò)增采用TransTaq DNA Polymerase HiFi Fidelity（北京全式金生物技術(shù)有限公司）體系，參照試劑盒說明書；程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物純化回收參照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書進(jìn)行，連接克隆載體pMD18-T，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行驗(yàn)證，測序（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

表1　引物序列

1.4McHMGR保守區(qū)的生物信息學(xué)分析

利用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行氨基酸序列同源性比對；利用MEGA5.2軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5McHMGR實(shí)時熒光定量PCR表達(dá)分析

分別提取處于花芽期、大花蕾期、初花期、盛花期四個時期的白蘭花瓣總RNA，按照TransScript Reverse Transcriptase試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書合成白蘭花第一鏈cDNA。根據(jù)McHMGR保守區(qū)序列設(shè)計(jì)熒光定量 PCR引物McHMGR-RT-F，McHMGR-RT-R（表1），以白蘭花18s-rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，采用GoTaq? qPCR Master Mix（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行McHMGR熒光定量PCR分析（BIO-RAD icycler realtime quantity PCR儀）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)釆用2-△△Ct法進(jìn)行定量分析。

2　結(jié)果與分析

2.1McHMGR保守區(qū)序列的克隆以及生物信息學(xué)分析

通過RT-PCR技術(shù)獲得白蘭花HMGR基因的保守區(qū)序列，該序列長為421bp，編碼128個氨基酸。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，結(jié)果表明，該序列推導(dǎo)出該基因編碼的氨基酸序列與樂昌含笑（Michelia chapensis）相似性達(dá)99%，與野生大豆（G.sija Sleb.et Zucc.）、魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）相似性分別為91%、89%、88%。初步判斷該序列為白蘭花HMGR基因的保守區(qū)片段，將該基因命名為McHMGR。

利用MEGA5.2軟件對McHMGR氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），構(gòu)建方法為鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ）。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，所獲得到的McHMGR與同為木蘭科含笑屬樂昌含笑（Michelia chapensis）的HMGR基因?qū)儆谕环种ВM(jìn)一步確定該序列為白蘭花的HMGR基因片段。

2.2McHMGR實(shí)時熒光定量PCR表達(dá)分析

采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，以白蘭花的18s-rRNA為內(nèi)參基因檢測McHMGR在白蘭花發(fā)育4個時期的表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明（圖1），該基因在花芽期表達(dá)量最低，隨著白蘭花的開放程度的增加呈上調(diào)趨勢，在大花蕾期間表達(dá)量迅速上調(diào)，盛花期時達(dá)到最高水平。

圖1　McHMGR核酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2　McHMGR氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3　白蘭花開放過程中McHMGR基因表達(dá)分析

3　討論

植物花朵的香氣成分是一類具有較低分子量的揮發(fā)性分子，主要由萜類、苯類/苯丙素類、脂肪酸衍生物和一些含氮或硫化合物等組成［12，13］。植物類異戊二烯包括單萜、倍半萜、二萜等，是一組結(jié)構(gòu)迥異的化合物家族［14］。HMGR是MAV途徑中第一個關(guān)鍵限速酶。本實(shí)驗(yàn)從白蘭花花瓣中克隆得到McHMGR保守區(qū)cDNA 421bp，編碼128個氨基酸。McHMGR推導(dǎo)出的氨基酸序列與其同屬植物樂昌含笑（Michelia chapensis）的相似度最高，達(dá)99%，與野生大豆（G.sija Sleb. et Zucc.）、魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）相似性分別為91%、89%、88%。初步判定其為白蘭花的HMGR基因。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，其與同屬的植物樂昌含笑的HMGR屬于同一分支，進(jìn)一步證明該片段為白蘭花HMGR基因的片段。

萜類物質(zhì)的代謝和植物的生長發(fā)育以及形態(tài)發(fā)生存在一定的相關(guān)性。陳大華認(rèn)為，特異的HMGR編碼基因成員的表達(dá)參與花的發(fā)育［15］。白蘭花為“體質(zhì)花”，在開花前就已經(jīng)積累了大量的香氣前體物質(zhì)，在整個開放過程中香氣含量都很高且變化幅度很?。?6］，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對McHMGR基因在白蘭花開放過程中的相對表達(dá)量動態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因在花芽期表達(dá)量最低，盛花期表達(dá)量達(dá)到最高，隨著白蘭花的開放程度總體呈上調(diào)趨勢，但花芽期與大花蕾期間上調(diào)最快，大花蕾期與初花期間基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定，初花期與盛花期間上調(diào)幅度較小。這與前人的研究結(jié)果一致，證明白蘭花開放的過程中香氣的釋放和McHMGR表達(dá)量存在一定程度的關(guān)聯(lián)。McHMGR的基因表達(dá)特異性為白蘭花窨茶或打底熏制茉莉花茶不用“養(yǎng)花”提供了分子機(jī)制研究依據(jù)。郭素枝［17，18］等研究表明，白蘭花初花期香氣成分含量最高；而熒光定量結(jié)果顯示，McHMGR在盛花期相對表達(dá)量最高，在大花蕾期之后持續(xù)高表達(dá)，這可能與下游的調(diào)控基因萜類合成酶基因的表達(dá)量有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

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葉乃興（1963-），男，教授，主要從事茶學(xué)與茉莉資源利用研究。E-mail：ynxtea@126.com。

福建省自然科學(xué)基金（2016J01110）；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015-PT-93）

林浥（1996-），女，本科生，主要從事茶樹遺傳育種與生物技術(shù)研究。