徐慶輝

(黃山市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 黃山　245000)

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高效液相色譜法測定消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量

徐慶輝

(黃山市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 黃山245000)

摘要：目的建立測定消炎止痢靈片中甲氧芐啶含量的高效液相色譜法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex Luna C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)，流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸銨)(33∶67)，檢測波長為270 nm。結(jié)果甲氧芐啶在0.1002～3.002 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.999 9)；平均回收率(n=6)為99.59%，RSD為0.22%。結(jié)論該方法簡單，準(zhǔn)確性高，精密度好，適合消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量測定。

關(guān)鍵詞：色譜法,高壓液相；甲氧芐啶；回收率

Determination of trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian by HPLC

1　儀器與試劑

1.1儀器高效液相色譜儀(島津LC-20AT)；AB135-S型十萬分之一型電子天平(梅特勒-托利多)； BS110S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯)；ARA520型百分之一電子天平(梅特勒-托利多)；ElmasonicP180H型超聲清洗器(德國艾瑪)。

1.2試劑乙腈(色譜純)；水(超純水)；其它試劑(分析純)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Phenomenex Luna C185 μm 4.6 mm×250 mm)；乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸銨)(33∶67)為流動相，檢測波長：270 nm，柱溫：30℃，流速：1.0 mL·min-1。在此條件下供試品溶液的甲氧芐啶峰與相鄰雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。其保留時間為6.25 min，色譜柱理論板數(shù)甲氧芐啶峰計算為38 074，對照品色譜圖見圖1，供試品色譜圖見圖2。在200～800 nm波長進(jìn)行掃描對照品溶液，甲氧芐啶的最大吸收波長在271 nm，選擇270 nm為檢測波長[4]。

2.2對照品溶液的制備精密稱取甲氧芐啶對照品0.010 01 g，置100 mL容量瓶中，用甲醇使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇溶液20 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W、頻率53 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4陰性對照溶液的制備按本品的制備工藝，制成甲氧芐啶的陰性對照樣品，再按供試品制備方法制成陰性對照溶液[5]。

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，依據(jù)上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～3。分離良好，陰性對照無干擾。

圖1　甲氧芐啶對照品的HPLC圖

圖2　供試品的HPLC圖

圖3　陰性對照的HPLC圖

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的考察精密吸取甲氧芐啶對照品溶液1、2、5、10、20、30 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以對照品的峰面積(Y)對甲氧芐啶對照品溶液的進(jìn)樣量(X)回歸，可得出得回歸方程，相關(guān)系數(shù)r等。

免耕播種技術(shù)是技術(shù)的一種方法，是在地表存在農(nóng)作物殘茬的基礎(chǔ)上，選擇使用免耕播種機(jī)，一次性完成農(nóng)作物播種施肥工作，有效降低了對土壤的翻動，減少機(jī)械設(shè)備在農(nóng)業(yè)耕地上的反復(fù)碾壓次數(shù)，降低人工成本投入。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取對照品溶液分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，計算RSD(%)值，考察對照品溶液的穩(wěn)定性。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(20141220批)樣品，照含量測定項(xiàng)下的測定方法，分別測定6次，記錄色譜圖，計算甲氧芐啶的含量(mg/g)及RSD(%)，考察樣品溶液的重復(fù)性。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取同一批號(20141220批)樣品(含量為18.149 mg/片)，取6份，每份1片，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入甲氧芐啶對照品適量置相應(yīng)的錐形瓶中，精密加70%乙醇溶液20 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W、頻率53 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。分別取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積計算本法的回收率[6]，結(jié)果見下表1。

2.9樣品測定及含量限度的確定按上述確定的色譜條件和測定方法，測定三批樣品下消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量，結(jié)果見表2。

3　結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線由2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，進(jìn)樣1、2、5、10、20、30 μL的峰面積為215882、434007、1119121、2235508、4468578、6836243。所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線：甲氧芐啶對照品在0.1002～3.002 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=230 000X-26 592，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

3.4加樣回收率由2.8實(shí)驗(yàn)方法所得加樣回收率的結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法測定下的平均回收率為99.59%，RSD為0.22%，說明該種實(shí)驗(yàn)方法可行。見表1。

表1　準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.5含量測定由2.9的實(shí)驗(yàn)方法可得：三批消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量較為穩(wěn)定。見表2。

表2　三批樣品含量測定結(jié)果

4　結(jié)論

4.1檢測波長的選擇取甲氧芐啶對照品溶液，照色譜條件依法進(jìn)樣，測定色譜峰在200～800 nm范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果如圖4所示，由圖可以看出甲氧芐啶不僅在271 nm處有最大吸收峰，而且在271 nm處峰的靈敏度較強(qiáng)，而其他無關(guān)峰的靈敏度相對較弱，因此就凸現(xiàn)出甲氧芐啶的峰，故選擇270 nm作為測定波長[7]。

圖4　甲氧芐啶的紫外光譜圖

4.2流動相的選擇采取高效液相色譜法測定藥品中甲氧芐啶含量的論文已有許多，根據(jù)不同文獻(xiàn)中提供的流動相，分別對水-乙腈-冰醋酸(65∶35∶2.5)、甲醇-水-醋酸(80∶19∶1)、乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2)、乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸銨)(33∶67)這四種流動相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明以乙腈-0.5%磷酸溶液(含1 mmol·L-1醋酸銨)(33∶67)為流動相時，甲氧芐啶峰與其他雜質(zhì)完全分離，且峰形更好[8]。

4.3提取方法的選擇(1)溶劑的選擇分別精密取10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇溶液各20mL，置于具塞瓶中，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，測定消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量，發(fā)現(xiàn)70%的乙醇溶液提取效率比其他乙醇溶液的提取效率好，所以采用70%乙醇溶液為提取劑[9]。

(2)提取方法的優(yōu)化比較回流加熱與超聲處理的優(yōu)越性，分別以70%乙醇溶液為提取劑，對供試品分別進(jìn)行加熱回流和超聲處理，發(fā)現(xiàn)超聲處理的效果較好，且操作起來也方便些，所以采取超聲處理10]。

(3)提取時間的確定取5份供試品溶液分別進(jìn)行超聲處理，提取時間依次設(shè)定為10、20、30、40、50 min，分別進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品在超聲處理30 min后提取率基本上沒有發(fā)生變化，最終確定超聲30 min為最佳提取時間[11]。

5　討論

利用高效液相色譜法測定消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量時，供試品溶液的主峰和甲氧芐啶對照品溶液的主峰在保留時間上是相同的，且甲氧芐啶的峰形較好[12]。

該樣品處理方法較簡單、方便且分離效果較好，有很好的專屬性和穩(wěn)定性，并且測定出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠、回收率高，是一種快速、靈敏、專屬的檢測方法，適合測定消炎止痢靈片中甲氧芐啶的含量。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.018

(收稿日期：2016-02-23，修回日期：2016-05-11)

XU Qinghui
(HuangshanInstituteforFoodandDrugControl,Huangshan245000,China)
Absract:ObjectiveTo establish a content determination method of trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian by HPLC.MethodDetermined by HPLC,the column was Phenomenex Luna C18(5 μm 4.6 mm×250 mm),the mobile phase was acetonitrile -0.5%Phosphoric acid(include 1 mmol·L-1ammonium acetate)，the ditection wavelength was 270 nm.ResultTrimethoprim was linear in the range of 0.1002～3.002 μg(r=0.999 9);the average recovery was 99.59% and RSD was 0.22%(n=6).ConclusionsThis method is simple,accurate,precision and available for the determination trimethoprim in Xiaoyanzhililing pian.

Key words:Chromatography,High Pressure Liquid；Trimethoprim；Retrieving rate