秦偉瀚， 師 萱， 花 雷， 白孝勇，張左香，舒興勇，郭延壘， 陽(yáng) 勇*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.云南省威信縣天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，云南威信 657900)

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UPLC-MS/MS法檢測(cè)不同產(chǎn)地野生天麻中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇含量

秦偉瀚1， 師 萱1， 花 雷1， 白孝勇2，張左香2，舒興勇2，郭延壘1， 陽(yáng) 勇1*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.云南省威信縣天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，云南威信 657900)

[目的]采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量。[方法]采用Phenomenex C18柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)，乙腈-5 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)水溶液作流動(dòng)相，流速0.2 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式(MRM-Pos)。[結(jié)果]天麻素在0.122 0～1 220.000 0 ng/mL、對(duì)羥基苯甲醇在0.502 0～5 020.000 0 ng/ mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。所有樣品中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量均超過《中國(guó)藥典》2015年版中“天麻”含量測(cè)定要求，按照2種成分總含量排序從大到小依次為云南昭通、貴州畢節(jié)、四川雅安、重慶城口、陜西漢中、甘肅隴南。[結(jié)論]該方法精密度、重現(xiàn)性和分離效果好，分析快速、準(zhǔn)確，適用于對(duì)天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的定性、定量研究。

天麻；超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用；天麻素；對(duì)羥基苯甲醇；含量

天麻(Gastrodiaelata Bl.)又名赤箭、獨(dú)搖芝、離母等，為蘭科天麻屬多年生草本植物的干燥塊莖[1]。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有關(guān)于天麻的記載，稱“赤箭”，沈括在《夢(mèng)溪筆談》中亦有記載：“世人惑于天麻之說，遂止用之治風(fēng)，良可惜哉”。至明朝李時(shí)珍《本草綱目》始稱“天麻”之名[2]。其味甘、性平，入肝經(jīng)[3]，既是傳統(tǒng)名貴中藥材，也是深受現(xiàn)代人青睞的保健食材[4]。天麻中富含天麻素、香莢蘭素、對(duì)羥基苯甲醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等多種有效活性成分[5]。天麻素是天麻中的主要成分，其含量高低直接影響藥材的質(zhì)量，而對(duì)羥基苯甲醇作為天麻素的苷元，在天麻中含量也是頗高。隨著天麻主產(chǎn)地野生資源日漸枯竭，其在藥市上的售價(jià)往往是家種天麻的數(shù)倍，對(duì)于普通消費(fèi)者而言不僅價(jià)高，且難以辨別，因而野生天麻品質(zhì)優(yōu)劣也愈發(fā)受到消費(fèi)者的關(guān)注。筆者采集了全國(guó)5個(gè)主要產(chǎn)區(qū)的野生天麻，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定其中主要化學(xué)成分的含量，為馴化野生天麻以便于選擇更為合適地域提供科學(xué)依據(jù)，也為天麻產(chǎn)業(yè)中質(zhì)量控制環(huán)節(jié)提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器。LC-30A型超高效液相色譜儀(日本島津公司)；API4000型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)；高速中藥粉碎機(jī)(廣東新豐機(jī)械公司)；BSA224S型萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮公司)；HH-S8型水浴鍋(江蘇新寶儀器公司)；KH-55A型烘箱(廣東康恒公司)。

1.1.2藥材與試劑。收集到6批天麻樣品，分別來源于重慶城口、貴州畢節(jié)、云南昭通、四川雅安、陜西漢中及甘肅隴南，經(jīng)重慶市中藥研究院劉翔副研究員鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的鮮品塊莖。天麻素(批號(hào)110807-200205，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào)UMJ5A-SM，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，乙腈、水(色譜級(jí)，德國(guó)merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜級(jí)，美國(guó)ACS公司)，乙醇(分析純，重慶川東化工公司)。

1.2方法

1.2.1藥材預(yù)處理。將不同產(chǎn)地鮮品天麻洗凈，切成薄片，于蒸鍋上蒸制30 min，取出置于烘箱中60 ℃干燥6 h，高速粉碎機(jī)粉碎成細(xì)末，過3號(hào)篩備用。

1.2.2色譜條件。采用菲羅門Luna C18柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，流速0.2 mL/min。流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～2 min，5%～20% B；2～3 min，20% B；3.0～3.1 min，20%～5%B，3.1～5.0 min，5% B。

1.2.3質(zhì)譜條件。噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力35 Psi；氣簾氣壓力15 Psi；輔助加熱氣壓力50 Psi；離子源溫度400 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式；碰撞氣為Medium。定量離子對(duì)、定性離子對(duì)去簇電壓(Declustering potential，DP)、碰撞能量 (Collision energy，CE)見表1。

表1　多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)參數(shù)

注：* 為定量離子對(duì)。

Note: * was quantitative ion pairs.

1.2.4對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備。精密稱取天麻素及對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL含天麻素0.122 mg和對(duì)羥基苯甲醇0.502 mg的混合對(duì)照品溶液，避光，4 ℃環(huán)境儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5供試品溶液的制備。精密稱取樣品粉末約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流3 h，放冷，再次稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干。殘?jiān)右译?水(5∶95)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中。用乙腈-水(5∶95)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.6樣品制備。精密稱取6個(gè)產(chǎn)地的天麻樣品各3份，每份2 g，按“1.2.5”方法制備供試品溶液，測(cè)定天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1線性范圍及檢測(cè)限。取“1.2.4”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用色譜甲醇逐級(jí)稀釋為7個(gè)不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，按“1.2.2”色譜條件、“1.2.3”質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的線性回歸方程分別為Y=14 654.591 57X+ 7 210.417 17(r=0.999 4)、Y=1 421.507 14X+7 920.872(r=0.999 6)，表明天麻素在0.122 0～1 220.000 0 ng/mL、對(duì)羥基苯甲醇在0.502 0～5 020.000 0 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

以基線響應(yīng)的3倍和10倍作為該物質(zhì)的檢出限和定量限，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇檢出限(LOD)分別為0.006 2、0.015 2 ng/mL，定量限(LOQ)分別為0.024 5、0.054 5 ng/mL。2.1.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液分別在0、4、6、8、12 h進(jìn)樣2 μL測(cè)定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇的峰面積，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.53%、2.04%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.3重現(xiàn)性試驗(yàn)。精密稱取5份云南昭通的天麻粉末樣品，按照“1.2.5”方法進(jìn)行處理測(cè)定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇峰面積，測(cè)得其RSD分別為1.59%、2.34%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4精密度試驗(yàn)。取同一供試品溶液，按照“1.2.2”色譜條件、“1.2.3”質(zhì)譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析5次，測(cè)定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇峰面積，測(cè)得其RSD分別為1.68%、1.27%，表明該方法精密度良好。

2.1.5回收率試驗(yàn)。精密稱取5份已知含量的云南昭通天麻粉末約1 g，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，按照“1.2.5”方法進(jìn)行處理，制備供試品溶液，按照“1.2.2”色譜條件、“1.2.3”質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的量及回收率。由表2可知，該方法測(cè)定天麻素、對(duì)羥基苯甲醇的平均回收率分別為94.45%和92.78%，RSD分別為2.28%和2.41%。由此可見，該方法回收率高、偏差小、準(zhǔn)確度高。

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2不同產(chǎn)地天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量分析精密吸取天麻樣品溶液2 μL，按照“1.2.2”色譜條件、“1.2.3”質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算。由表3可見，所有樣品中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量均超過《中國(guó)藥典》2015年版中“天麻”含量測(cè)定要求，說明野生天麻質(zhì)量比較可靠；云南昭通天麻中天麻素、對(duì)羥基苯甲醇及總含量均高于其他樣品，而甘肅隴南樣品含量則均為最低值；按照2種成分總含量排序從大到小依次為云南昭通、貴州畢節(jié)、四川雅安、重慶城口、陜西漢中、甘肅隴南。

表3不同產(chǎn)地天麻中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇含量

Table 3The contents of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inG.elatain different production area

%

3　結(jié)論

該研究采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定6個(gè)產(chǎn)地天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量，結(jié)果表明，天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量測(cè)定方法的線性關(guān)系良好，線性范圍分別為0.122 0～1 220.000、0.502 0～5 020.000 ng/mL；所有樣品中2種主要成分的含量均超過《中國(guó)藥典》2015年版中“天麻”含量測(cè)定要求，說明野生天麻質(zhì)量比較可靠；按照2種成分總含量排序從大到小依次為云南昭通、貴州畢節(jié)、四川雅安、重慶城口、陜西漢中、甘肅隴南。云南昭通市野生天麻中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇總含量相對(duì)較高(0.94%)，為其作為全國(guó)天麻道地產(chǎn)區(qū)提供科學(xué)依據(jù)[6]；四川、貴州的含量與其差異不大，完全可以將這2個(gè)產(chǎn)地的天麻作為昭通天麻的替代品。研究中還發(fā)現(xiàn)不同緯度天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量有差異，而這差異為低緯度含量高于高緯度，這將需要深入研究得到進(jìn)一步證明。

該研究利用質(zhì)譜分析的特性，不需要樣品峰與雜質(zhì)峰達(dá)到完全分離，樣品用量少，且由結(jié)果可知天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的檢出限分別為0.006 23和0.015 20 ng/mL，表明該方法靈敏度高，特別適合天麻等傳統(tǒng)名貴中藥材樣品及基質(zhì)復(fù)雜樣品的含量測(cè)定。該方法精密度、重現(xiàn)性和分離效果好，分析快速、準(zhǔn)確，適用于對(duì)天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的定性、定量研究，為天麻及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：54-55．

[2] 孫星衍,孫馮翼.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1962:22.

[3] 李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：華文出版社,2009:71.

[4] 謝學(xué)強(qiáng),唐德華,彭宗杰,等.甘孜州野生天麻資源調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(29):27-28.

[5] 楊超,呂紫媛,伍瑞云.天麻的化學(xué)成分與藥理機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2012,50(17):27-31.

[6] 王興文,方波.昭通野生和栽培天麻中微量元素及氨基酸化學(xué)成分研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1994,17(4):1-5.

Determination of Gastrodine and 4-Hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelataBl. from Different Habitats by UPLC-MS/MS

QIN Wei-han, SHI Xuan, HUA Lei, YANG Yong*et al

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065)

[Objective] To develop an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelataBl. from six different habitats. [Method] The analyses were performed on a Phenomenex C18 column (50 mm×2.1 mm, 3 μm) with a mobile phase of acetonitrile -5 mmol/L ammonium acetate aqueous (0.1% formic acid) at a flow rate of 0.2 mL/min operating in MRM positive ion mode (MRM-Pos). [Result] Gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol contents showed good linearity in ranges of 0.122 0-1 220.000 0 and 0.502 0-5 020.000 0 ng/mL, respectively. In all the samples, gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol contents all exceeded the content determination requirements in Chinese Pharmacopoeia (2015 edition). These herbs ofGastrodiaelataBl. could be ordered according to the total content of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol: Zhaotong in Yunnan > Bijie in Guizhou > Ya’an in Sichuan > Chengkou in Chongqing > Hanzhong in Shanxi > Longnan in Gansu. [Conclusion] This method is quick, precise, rapid and accurate, and is suitable for the qualitative and quantitative research on gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inG.elata.

GastrodiaelataBl.; UPLC-MS/MS; Gastrodine; 4-Hydroxybenzyl alcohol; Content

秦偉瀚(1981- )，男，重慶人，助理研究員，從事中藥新藥開發(fā)、藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。*通訊作者，副研究員，碩士，從事中藥新藥開發(fā)、藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥物代謝研究。

2016-04-25

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)17-143-03