蘇巧玲，林雄平，阮政平

(寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德 352100)

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紅色新月蕨與烏毛蕨多糖的抗菌活性

蘇巧玲，林雄平*，阮政平

(寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德 352100)

[目的]從紅色新月蕨和烏毛蕨中提取多糖物質(zhì)，并檢測多糖含量及其對5種菌類的抑菌活性。[方法]采用水提醇沉法對紅色新月蕨和烏毛蕨多糖進行提取，并采用苯酚-硫酸比色法和圓形紙片法測定多糖含量以及測量不同濃度不同菌種的抑菌圈直徑。[結(jié)果]紅色新月蕨的多糖比烏毛蕨的多糖在含量上多0.3%，紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖對藤黃八疊球菌的抑菌圈直徑分別可達33.0和21.3 mm，紅色新月蕨多糖對酵母菌的抑菌圈直徑為15.0 mm，烏毛蕨多糖對青霉菌的抑菌圈直徑為22.0 mm，紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的最小抑菌濃度均集中在5～15 mg/mL。[結(jié)論]紅色新月蕨和烏毛蕨多糖可作為功能性多糖加以開發(fā)。

紅色新月蕨；烏毛蕨；多糖；抑菌活性

蕨類植物是低等的維管植物，它不僅可成為人類的食品，還具有藥用價值[1]。紅色新月蕨(Pronephriumlakhimpurnense(Rosenst.)Holtt.)屬于金星蕨科，植株高達1.5 m以上，根狀莖長而橫走，通常長在海拔400～1 000 m的林下或溝溪邊濕地。主要生長在我國福建、廣東、廣西、四川等，在印度和越南等地也有。我國的傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)說認(rèn)為，紅色新月蕨有清熱解毒、祛瘀止血功效，主治疔瘡癤腫、跌打損傷、外傷出血等。烏毛蕨(BlechnumorientaleL.)屬于烏毛蕨科，不僅可食用，其在藥用上也有很大的價值，其根狀莖可藥用，有清熱解毒、活血散淤之效，食用烏毛蕨幼株具有清熱解毒、除濕、健脾胃等功效[2]。

現(xiàn)代越來越多的研究表明，蕨類植物含有多種天然抗微生物和抗腫瘤活性物質(zhì)[3]，而藥用蕨類植物的用途正隨著其他邊緣學(xué)科迅速發(fā)展而日益廣泛和擴大。有研究表明，烏毛蕨的水提液具有一定的抑菌活性[4]，但對于烏毛蕨的多糖物質(zhì)的提取及抗菌活性尚無報道。另外，對于紅色新月蕨的多糖物質(zhì)提取的抗菌活性研究國內(nèi)外也尚無報道。為此，該試驗從來源簡單、分布廣泛的紅色新月蕨與烏毛蕨中提取多糖，著重研究紅色新月蕨與烏毛蕨中多糖提取物對5種菌類的抑菌活性，為紅色新月蕨和烏毛蕨的資源開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料采摘新鮮的紅色新月蕨與烏毛蕨植株，采集地為寧德后山。真菌：啤酒酵母菌(SaccharomycescarlsbergensisHansen)、青霉菌(PenicilliumchrysogenumThom)。細(xì)菌：枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCohn)、藤黃八疊球菌(SarcinaluteaSchroeter)、大腸桿菌(EscherichiacoliCastellani et Chalmers)。菌種均來自寧德師范學(xué)院微生物學(xué)實驗室。

1.2方法

1.2.1材料前處理。將采摘回來的新鮮紅色新月蕨與烏毛蕨植株經(jīng)種類鑒定后，進行清洗并置于陰涼處風(fēng)干。待其干燥后，用植物粉碎機粉碎成40目，用密封袋封好，備用。

1.2.2紅色新月蕨與烏毛蕨的多糖提取。稱取紅色新月蕨和烏毛蕨的干粉末各100 g，并分別倒入2個燒杯中各加入1 000 mL蒸餾水浸泡完全靜置24 h，將其放置于100 ℃中的水浴下加熱1 h，再將溫度調(diào)低至70 ℃水浴加熱2 h，用紗布過濾，將清液留著，倒掉濾渣。把清液放置在70 ℃的水浴條件下，將清液濃縮成100～150 mL。把3倍體積的無水乙醇加入濃縮液中，對其離心得到沉淀，用3%三氯乙酸溶液徹底溶解沉淀后，對其再次離心取上清液。在40～50 ℃水浴的條件下將上清液蒸至恒重，并稱重。

1.2.3多糖含量的測定。

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖1.0 g，加水定容至100 mL，吸取2.0 mL定容至100 mL。

1.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，補水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，再加入濃硫酸5 mL，振蕩均勻。置于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻后用分光光度計在490 nm處以試劑空白溶液為參比測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得出回歸方程為：y=0.905 7x+0.164 3(R2=0.905 5)。

圖1　紅色新月蕨和烏毛蕨多糖復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of polysaccharide compounds from P.lakhimpurense and B.orientale

1.2.3.3樣品總糖含量的測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚—硫酸法測定總糖含量。吸取適量樣液，加蒸餾水至2.0 mL，按“1.2.3.2”方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣液中多糖濃度(以葡萄糖計)。樣品多糖濃度計算公式如下：

多糖含量(m)=C·V測·N

多糖提取率=(m/M)×100%

式中，C為所測多糖溶液濃度；V測為多糖溶液測定體積；N為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量。

1.2.4抗菌效果測定。采用圓形紙片法進行測定。刮取已活化的不同菌種于不同試管中(內(nèi)有5 mL無菌水中)，分別搖勻得不同菌種的菌懸液，將其倒入40～45 ℃條件的相應(yīng)培養(yǎng)基中，快速搖勻后，快速倒于培養(yǎng)皿中待用。分別用移液槍將20 μL的多糖樣品注入已消毒的圓形濾紙(Φ=6 mm)，等待圓形濾紙片稍微干后貼于已凝固的培養(yǎng)基平板上面，同時另作一組空白對照。不同的菌種分別放置于相應(yīng)

的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌種成長后觀察結(jié)果，并測量不同濃度不同菌種的抑菌圈寬度。以上步驟均要在無菌條件下操作完成。

1.2.5最小抑菌濃度測定。把多糖溶液稀釋成2.5、5.0、7.5、15.0、30.0 mg/mL的濃度梯度，利用圓形紙片的方法，以未見抑菌圈的最高濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

2　結(jié)果與分析

2.1紅色新月蕨與烏毛蕨多糖的提取率及其含量從表1可看出，紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的得率和含量差別不是很大，紅色新月蕨的多糖含量比烏毛蕨的多糖含量多0.3%，二者的多糖含量無太大的差異；烏毛蕨的多糖提取率比紅色新月蕨多2.59%。

表1紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖得率與含量

Table 1The yield and content of polysaccharide fromP.lakhimpurenseandB.orientale

蕨類Fern多糖得率Polysaccharideyield∥%多糖含量Polysaccharidecontent∥%紅色新月蕨P.lakhimpurense14.3012.66烏毛蕨B.orientale16.8912.36

2.2紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的抑菌圈大小由表2可見，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時，紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖對5種菌類有一定的廣譜抗菌活性，其抑菌圈直徑為6.0～33.0 mm。從總體上看，2種蕨類的抗菌活性比較穩(wěn)定，抑菌圈直徑相差不大，烏毛蕨多糖對真菌中的青霉菌抑菌效果最大，為22.0 mm，而其多糖對細(xì)菌的抑菌效果有明顯的差異，抑菌圈直徑最小9.5 mm，最大達21.3 mm。紅色新月蕨對真菌的抑菌效果相差不大，對酵母菌和青霉菌的抑菌圈直徑僅相差1.8 mm，對真菌的抑菌圈直徑均可達十幾毫米，而對細(xì)菌的抑菌圈直徑差異非常明顯，最大的藤黃八疊球菌的抑菌圈直徑是最小的大腸桿菌的5倍多。

表2　紅色新月蕨與烏毛蕨多糖的抑菌圈直徑大小

2.3紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)從表3可以看出，各種蕨類的多糖提取物對同一種菌的MIC存在一定差異，同一種蕨類植物的多糖提取物對不同菌種的MIC也有所不同；紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的MIC均集中在5～15 mg/mL。

表3　紅色新月蕨和烏毛蕨多糖提取的最小抑菌質(zhì)量濃度

3　討論

把干燥后的紅色新月蕨和烏毛蕨樣品粉碎成粗粉末，可以增加樣品的表面積，可加速樣品中有效成分的浸出。陳曉

清等[5]對9種蕨類植物多糖的提取發(fā)現(xiàn)，華南毛蕨多糖提取率最高，達12.10%；腎蕨多糖提取率最低，僅為3.80%；多糖含量最高的是芒萁，為24.30%，最低的是華南毛蕨，僅為1.34%。而此次試驗中紅色新月蕨和烏毛蕨多糖的提取率均比華南毛蕨的多糖提取率高，紅色新月蕨的多糖提取率比華南毛蕨的高2.20%，烏毛蕨的多糖提取率比華南毛蕨的高4.79%；紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖含量比芒萁分別少11.64%和11.94%，但紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖含量卻比華南毛蕨的多，分別多11.32%和11.02%?？梢?，不同的蕨類其多糖的提取率和含量是有所差異的，這些差異與其生長的環(huán)境直接相關(guān)。

陶海南等[6]首次從紫萁中分離提取多糖，其得率為25.8%，對藤黃八疊球菌的抑菌圈為8.0 mm，而此次試驗中紅色新月蕨和烏毛蕨的多糖對藤黃八疊球菌的抑菌圈分別為33.0和21.3 mm，明顯高于紫萁的抑菌效果。此次試驗結(jié)果顯示，紅色新月蕨和烏毛蕨中提取的多糖得率為14.30%和16.89%，且從紅色新月蕨和烏毛蕨中提取的多糖對枯草芽孢桿菌、青霉菌、啤酒酵母菌、藤黃八疊球菌、大腸桿菌這5種菌類均有抗菌活性，說明這2種蕨類多糖具有廣譜抗菌性。我國民間中醫(yī)一直有用水煎煮蕨類植物用以治療某些病癥，因此此次試驗也采用100 ℃的水浴法提取多糖物質(zhì)，是以研究源于生活，便于以后的大面積推廣。此外，許柑葉等[7]通過蕨類抗菌篩選認(rèn)為采用不同的提取劑、提取時間等提取條件，選擇不同的受試菌均有可能產(chǎn)生相異的抗菌結(jié)果。該試驗結(jié)果表明蕨類種類不同其抗菌活性差異較大，這與許柑葉等[7]的報道一致。

蕨類植物來源廣泛，成本低，對于一些常見的菌類有明顯的抑菌效果，具有明顯的藥用價值，在條件允許的情況下可大面積推廣使用，但紅色新月蕨和烏毛蕨二者的多糖提取物是否還有其他藥用價值有待于進一步的深入研究。

[1] 許樂仁.蕨和與蕨相關(guān)的動物病[M].貴陽：貴州科技出版社，1993：8-10.

[2] 羅來輝.烏毛蕨的開發(fā)利用探索[J].內(nèi)江科技，2006(8)：131-132.

[3] 蔡建秀，吳文杰，葛清秀.20種藥用蕨類植物提取液抑菌試驗研究[J].亞熱帶植物科學(xué)，2004，33(1)：22-25.

[4] 福建植物志編寫組.福建植物志：第一卷[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1982：18-19.

[5] 陳曉清，許柑葉.九種蕨類植物多糖提取物抗動植物病原菌活性[J].亞熱帶植物科學(xué)，2007，36(1)：43-45.

[6] 陶海南，劉輝， 薛喜文，等.紫萁多糖抗菌活性初步研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(理科版)，1996，20(4)：306.

[7] 許柑葉，鄭怡，陳曉清.8種蕨類植物多糖提取物抑菌效果的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，21(2)：99-102.

Antimicrobial Activity of the Polysaccharide fromPronephriumlakhimpurenseandBlechnumorientale

SU Qiao-ling, LIN Xiong-ping*, RUAN Zheng-ping

(Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde, Fujian 352100)

[Objective] The aim was to extract polysaccharide fromPronephriumlakhimpurenseandBlechnumorientale, detect polysaccharide content and its antimicrobial activity. [Method] Polysaccharide fromP.lakhimpurnenseandB.orientalewere extracted through ethanol subsiding method. The polysaccharide content and antimicrobial activity was tested through the circle agar disc diffusion andMICtesting method. [Result] The polysaccharide content inP.lakhimpurnensewas 0.3% more than that inB.orientale,P.lakhimpurnenseandB.orientalepolysaccharide showed the antimicrobial acticity againstSarcinalutea, the inhibition zone was up to 33.0 mm and 21.3 mm. The inhibition zone ofP.lakhimpurnensepolysaccharides againstSaccharomycescarlsbergensiswas 15.0 mm. The inhibition zone ofB.orientalepolysaccharides againstPenicilliumchrysogenumwas 22.0 mm. The minimal inhibitory concentration of polysaccharides fromP.lakhimpurnenseandB.orientalewas in the range of 5-15 mg/mL. [Conclusion] Polysaccharide fromP.lakhimpurenseandB.orientalecould be used as functional polysaccharide.

Pronephriumlakhimpurnense;Blechnumorientale;Polysaccharides; Antibacterial activity

福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510398047)；寧德市科技計劃項目(20140237)；寧德師范學(xué)院服務(wù)寧德項目(2013F18)。

蘇巧玲(1995- )，女，福建漳州人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事藻類學(xué)研究。

2016-04-13

S 567

A

0517-6611(2016)17-141-02