李 巖，趙 宏，王宇亮，初 維，張 宇

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

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白蘞多糖的分離純化及其對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

李 巖，趙 宏，王宇亮，初 維，張 宇*

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

[目的]分離純化白蘞多糖，研究白蘞均一多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。[方法]采用水提醇沉法提取白蘞多糖，通過三氯乙酸法脫除蛋白，用中空纖維超濾膜和DEAE Cellulose DE-52對白蘞多糖進(jìn)行分離純化，高效凝膠過濾色譜法鑒定純度并測定分子量，PMP柱前衍生化測定單糖組成，采用MTT法測定均一多糖對ConA和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。[結(jié)果]PAJM-A均一多糖分子量為1.29×105u，由甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xly)組成，其物質(zhì)的量比為1.36∶1.87∶2.02∶1.58∶1.04，均一多糖對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞有較顯著的增殖作用。[結(jié)論]PAJM-A是一種新的白蘞均一多糖，并與ConA、LPS 對T、B淋巴細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用。

白蘞；多糖；分離純化；脾淋巴細(xì)胞

白蘞為葡萄科蛇葡萄屬植物白蘞AmpelopsisJaponica(Thunb.)Makino的干燥塊根[1]，廣泛分布于華東、華北、中南、遼寧、吉林、貴州、廣西等地。其味苦、辛、微寒，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、斂瘡生肌之功效。白蘞中的化學(xué)成分復(fù)雜，目前已從中分離獲得多糖類[2]、黃酮類[3-5]、有機(jī)酸類[6]、三萜[7]、甾醇類等成分，臨床用于治療瘡癰腫毒、燒燙傷、癌性發(fā)熱、支氣管擴(kuò)張咯血、手足皸裂、骨折等[8-13]。筆者對白蘞多糖進(jìn)行分離純化，并選擇小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)考察其對免疫作用的影響，旨在為研發(fā)理想的用于免疫調(diào)節(jié)的中藥組分奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1儀器UV757CRT紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LG10-2.4A型高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；3 500 u透析袋(上海源葉生物科技有限公司)；FDU-1200型真空冷凍干燥機(jī)(日本東京理化株式會(huì)社)；FA2004電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；TDL-5000B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Waters-600高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters-2424 蒸發(fā)光檢測器(美國Waters公司)；BSZ-100自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠)；FTIR-8400S型紅外光譜儀(日本島津有限公司)；SW-CJ-2FD型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2試劑白蘞由安國市萬聯(lián)中藥飲片有限公司提供，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室張宇教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬中藥白蘞，鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸均為Pharmacia公司產(chǎn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>99%；DEAE Cellulose 52(Whatman公司)；三氟乙酸(美國Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1白蘞多糖的提取與分離純化。 取白蘞干燥塊根1 kg，用90%乙醇回流提取3次，每次2 h，棄去提取液，藥渣加8倍量的水，回流提取3次，每次2 h，合并提取液，過濾濃縮，加入乙醇醇沉，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h，抽濾得沉淀后冷凍干燥得白蘞粗多糖。粗多糖用三氯乙酸法除蛋白后醇沉，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌，得白蘞多糖PAJM。

稱取PAJM溶液依次過中空纖維超濾膜(150、100、50、20、10和6 ku)，用DEAE-52(80 cm×3 cm)進(jìn)一步分離，用0～1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，采用苯酚硫酸法測定吸光度(A490)，收集洗脫液，透析，減壓濃縮，冷凍干燥，得到均一多糖PAJM-A，備用。

1.3.2純度及分子量測定。 采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC-ELSD)分析：色譜柱為Ultrahydrogel TM(Linear)水溶性凝膠柱(7.8 mm×300.0 mm)，標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(T20、T40、T110、T500、T2000)配制成2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，以色譜峰的保留時(shí)間(Rt)為橫坐標(biāo)，lgMw為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多糖分子量的測定：配制PAJM-A 2 g/L的溶液，以三蒸水作為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃。檢驗(yàn)其純度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程得到PAJM-A的分子量。

1.3.3PAJM-A單糖組成分析。

1.3.3.1混合單糖對照品溶液的制備。精密稱取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、木糖8種單糖對照品各10 mg，用雙蒸水配成1 mmol/L的混合單糖對照品儲(chǔ)備液。

1.3.3.2PAJM-A的水解。取PAJM-A 5 mg，加2 mL 2 mol/L TFA，封管后于120 ℃水解160 min，冷卻后，將水解樣品溶液加甲醇洗滌反復(fù)旋干，加入700 μL蒸餾水，備用。

1.3.3.3單糖對照品及PAJM-A水解產(chǎn)物的衍生化標(biāo)記。分別取單糖對照品混合溶液和PAJM-A水解產(chǎn)物各700 μL，加入0.5 mol/L重蒸PMP甲醇溶液350 μL、0.3 mol/L NaOH溶液350 μL渦旋混勻，于70 ℃反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液350 μL進(jìn)行中和，加1 mL乙酸異戊酯萃取2次，再加入氯仿2 mL渦旋混勻，棄去氯仿液，重復(fù)3次后將水相過0.45 μm微孔濾膜供HPLC進(jìn)樣分析。

1.3.3.4色譜條件。ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱：流動(dòng)相磷酸鹽緩沖溶液-乙腈(83∶17)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長245 nm，進(jìn)樣量10 μL[14]。

1.3.4紅外光譜分析。取均一多糖PAJM-A 1 mg與干燥的KBr粉末100 mg混合壓片，在紅外光譜儀4000～400 cm-1掃描，記錄紅外光譜圖[15]。

1.3.5ConA和LPS誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。脾淋巴細(xì)胞懸浮液的制備參照文獻(xiàn)[16-17]，在96孔培養(yǎng)板中每孔依次加入濃度為1×108個(gè)/mL的小鼠脾細(xì)胞懸液100 μL，除最外圈的空白對照加100 μL PBS，放入CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，剩下的60孔再加入ConA和LPS 20 μL使其終濃度為5 μg/mL，每孔加入不同稀釋度的多糖溶液(RPMI-1640培養(yǎng)液配制)80 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。放置在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入二甲基亞砜100 μL，充分振蕩，于酶標(biāo)儀上492 nm處測定吸光度。

1.4數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)以均值±方差表示，組間用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2　結(jié)果與分析

2.1純度及分子量經(jīng)高效凝膠色譜鑒定純度，色譜峰形基本上是單一而尖銳，說明多糖中相對分子質(zhì)量分布較均一。標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-0.711 1X+11.706(R2=0.994 6)，分子量在20 000～200 000 u線性關(guān)系良好(圖1)。PAJM-A出現(xiàn)對稱的單一峰，可判斷PAJM-A為均一多糖，PAJM-A保留時(shí)間(tR)為9.280 min，分子量(Mw)為1.29×105u(圖2)。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of standard glucan

圖2　PAJM-A的高效液相凝膠滲透色譜圖Fig.2　High performance liquid gel permeation chromatogram of PAJM-A

2.2PAJM-A單糖組成混合標(biāo)準(zhǔn)單糖對照品經(jīng)PMP柱前衍生后，進(jìn)行HPLC分析后得到8種標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜峰，混合單糖對照品及樣品的HPLC色譜見圖3。PAJM-A經(jīng)衍生化后通過HPLC測定其單糖組成，結(jié)果表明，PAJM-A由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖組成，物質(zhì)的量比為1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04。

圖3　對照品(A)和PAJM-A(B)衍生產(chǎn)物的HPLCFig.3　HPLC of reference substances (A)and PAJM-A(B)derived products

2.3IR分析PAJM-A的紅外光譜圖見圖4。由圖4可知，在3 500～3 300 cm-1有一個(gè)強(qiáng)且寬的O-H伸縮振動(dòng)峰；次甲基-CH-的伸縮振動(dòng)在3 000～2 800 cm-1出現(xiàn)一個(gè)小峰，是糖類的特征峰；1 400～1 200 cm-1的一組峰則是C-H的伸縮振動(dòng)引起的，在1 735 cm-1左右無吸收，表明PAJM-A不含糖醛酸，在890 cm-1左右有吸收峰，可能為β-吡喃糖苷鍵。

圖4　PAJM-A的紅外光譜Fig.4　Infrared spectroscopy of PAJM-A

2.4PAJM-A對ConA和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的影響由表1可知，空白對照組與陽性對照組相比具有極顯著性差異(P<0.01)，ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖，提示造模成功，藥物組與空白對照組相比，各組吸光度均有極顯著差異(P<0.01)，提示PAJM-A對ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，且在200～800 μg/mL與ConA誘導(dǎo)劑有協(xié)同作用，并具有明顯的量效關(guān)系。

表1PAJM-A對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

Table 1Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte induced by ConA

組別Group濃度Concentrationμg/mLODODvalue空白對照組Blankcontrolgroup00.191±0.007陽性對照組Positivecontrolgroup00.258±0.015**PAJM-A8000.359±0.019**4000.305±0.008**2000.271±0.014**

注： 與空白對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，n=6。

Note： Compared with control group，* indicated significant differences (P<0.05)；** indicated extremely significant differences (P<0.01)，n=6.

由表2可知，陰性對照組與空白組相比，吸光度明顯升高，且有極著性差異(P<0.01)，說明LPS能引起小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖。藥物組與空白對照組相比，各組吸光度均有極顯著差異(P<0.01)，提示PAJM-A對LPS誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，且在200～800 μg/mL與LPS誘導(dǎo)劑有協(xié)同作用，并具有明顯的量效關(guān)系。

3　結(jié)論與討論

免疫學(xué)研究的一個(gè)重要方向在于將基礎(chǔ)免疫學(xué)研究的成果應(yīng)用于感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等重要疾病發(fā)病機(jī)制的研究、特異性的預(yù)防和治療措施的建立、新型疫苗的研制和開發(fā)等[18]。多糖為單糖組成的天然高分子化合物，20世紀(jì)60年代后多糖作為廣譜免疫促進(jìn)劑引起人們極大興趣，趙武連[19]、張慶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，多糖對淋巴細(xì)胞有一定的促進(jìn)增殖作用。脾臟是最大外周免疫器官，是B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的定居場所，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中非常重要的免疫細(xì)胞[21]，PAJM-A能有效促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，并與ConA、LPS對T、B 淋巴細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用。

表2PAJM-A對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

Table 2Effects of PAJM-A on proliferation of mice spleen lymphocyte induced by LPS

組別Group濃度Concentrationμg/mLODODvalue空白對照組Blankcontrolgroup00.203±0.055陽性對照組Positivecontrolgroup00.249±0.080**PAJM-A8000.453±0.011**4000.327±0.012**2000.304±0.076**

注：與空白對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，n=6。

Note： Compared with control group，* indicated significant differences (P<0.05)；** indicated extremely significant differences (P<0.01)，n=6.

該研究首次對中藥白蘞中免疫活性成分多糖進(jìn)行分離純化，為進(jìn)一步分析白蘞多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)以及今后研究其構(gòu)效關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。高效凝膠滲透色譜法是目前測定多糖純度和分子量的常用方法，具有快速、準(zhǔn)確、分辨率高、重現(xiàn)性好、樣品量小等優(yōu)點(diǎn)[22]。白蘞多糖為水溶性多糖，在提取多糖時(shí)需要脫掉脂溶性成分，用無水乙醇和丙酮洗去雜質(zhì)和一些色素，可以提高多糖的含量。在對粗多糖進(jìn)行分離純化時(shí)，DEAE-52的純化效果較好，經(jīng)HPGPC-ELSD檢測后，PAJM-A呈單一對稱峰，說明純度可達(dá)98%以上，是均一多糖。該研究采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法[23]測定單糖組成，結(jié)果表明，PAJM-A的單糖組成均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖組成，其物質(zhì)的量比為1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04。該研究結(jié)果表明，白蘞含大量的具有顯著生物活性的多糖類成分，這進(jìn)一步深化了對常用中藥白蘞藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和功效的認(rèn)識，為合理開發(fā)利用白蘞藥材提供理論依據(jù)。

[1] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志：第一冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1959：404.

[2] 林慧君，陳衛(wèi).白蘞多糖PAJM-I的分離純化和結(jié)構(gòu)分析[J].海峽藥學(xué)，2008，20(4)：102-104.

[3] 郭麗冰.廣東白蘞的分離與鑒定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，13(1)：1-6.

[4] 郭麗冰，盧雁，陳水平.白蘞化學(xué)成分的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，12(3)：145-147.

[5] 俞文勝，陳新民，楊磊，等.白蘞單寧化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995，7(1)：15-18.

[6] 赫軍，羨冀，宋瑩瑩，等.白蘞化學(xué)成分的研究[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25(8)：636-638.

[7] 鄒濟(jì)高，金蓉鸞，何宏賢.白蘞化學(xué)成分研究[J].中藥材，2000，23(2)：91-93.

[8] 張春寶，曹雙全，高增書，等.康泰燙傷藥膜的研制及質(zhì)量控制[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1999，14(2)：39.

[9] 苗晉鑫，白明，郭曉芳，等.白蘞對大、小鼠燙傷模型的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，19(18)： 86-89.

[10] 湯佩佩，郭曉芳，白明，等.白蘞外用對瘡瘍模型的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，29(4)：65-68.

[11] BEROVIC M，HABIJANIC J，ZORE I，et al.Submerged cultivation ofGanodermalucidumbiomass and immunostimulatory effects of fungal polysaccharides[J].Journal of biotechnology，2003，103(1)：77-86.

[12] HATTORI T S，KOMATSU N，SHICHIJO K，et al.Protein-bound polysaccharide K induced apoptosis of the human Burkitt lymphoma cell line，Namalwa[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2004，58(4)：226-230.

[13] UMEMURA K，YANASE K，SUZUKI M，et al.Inhibition of DNA topoisomerases Iand II，and growth inhibition of human cancer cell lines by a marine microalgal polysacch-aride[J].Biochemical pharmacology，2003，66(3)：481-487.

[14] 茅蕾蕾，陳穎，胡碧原，等.銀杏外種皮多糖的單糖組成分析[J].中國中藥雜志，2014，39(2)：262-266.

[15] 周寶珍，肖婭萍，?？》?，等.絞股藍(lán)多糖的分離純化及紅外光譜、氣相色譜分析[J].中國中醫(yī)藥雜志，2012，27(1)：97-100.

[16] 長城，趙海霞，姜美杰，等.竹節(jié)參多糖對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的恢復(fù)作用研究[J].中藥材，2011，34(1)：91-94.

[17] HAKKI A，HALLQUIST N，F(xiàn)RIEDMAN H，et al.Differential impact of nicotine on cellular proliferation and cytokine production by LPS-stimulated murine splenocytes[J].Int J Immunopharmaco，2000，22(6)：403-410.

[18] 劉娟，曹雪濤.2014年國內(nèi)外免疫學(xué)研究重要進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2015，31(1)：1-11.

[19] 趙武連.植物多糖提取物致有絲分裂反應(yīng)的分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1991，11(6)：381.

[20] 張慶，雷林生，林勤保，等.大棗多糖體外抗補(bǔ)體活性及促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用[J].中藥藥理與臨床，1998，14(5)：19-21.

[21] 陳志國，葉松山，范迎，等.金釵石斛多糖提取工藝的優(yōu)化及對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(15)：27-32.

[22] 王宇亮，唐雨薇，趙宏，等.一種糖槭葉多糖的提取分離及結(jié)構(gòu)分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26(10)：2371-2374.

[23] 趙宏，柴桂芳，王秋紅，等.一種車前子多糖的分離純化及單糖組成分析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(19)：97-100.

Separation and Purification of Polysaccharides fromAmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino and Its Effects on Proliferation Function of Mice Spleen Lymphocyte

LI Yan, ZHAO Hong, WANG Yu-liang, ZHANG Yu*et al

(College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

[Objective] To separate and purify polysaccharides fromAmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino, and to study its effects on proliferation function of mice spleen lymphocyte transformation. [Method] Hot water extracting and TCA method were employed to isolate the PAJM. Hollow fiber ultrafiltration membrane and the DEAE Cellulose 52 were used to separate and purify polysaccharides, and the monosaccharide composition, and structure were preliminarily identified by IR and HPLC. Their effects on proliferation function of mice spleen lymphocyte transformation were determined by MTT. [Result] PAJM-A was 1.29×105u and it was mainly composed of Man, Rha, GlcA, Glc, Gal and Xyl in the molar ratio of 1.36∶1.87∶2.02∶0.10∶1.58∶1.04. And the homogeneous polysaccharides were able to increase the proliferation of lymphocytes induced by ConA and LPS. [Conclusion] PAJM-A is a novel homogeneous polysaccharide, PAJM-A can effectively increase lymphocyte proliferation and enhance the effect of ConA, LPS-induced T and B cell growth.

AmpelopsisJaponica(Thunb.) Makino; Polysaccharides; Separation and purification; Spleen cell

佳木斯大學(xué)校級創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(CXTD-2013-05)；佳木斯大學(xué)青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(22Zq201501)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(LZZ2015_030)。

李巖(1992- )，女，黑龍江寶清人，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事天然藥物有效成分的分離及結(jié)構(gòu)研究。

2016-05-13

S 567

A

0517-6611(2016)17-137-04