姜 燕， 崔曉翠， 張 正， 景亞運(yùn)， 王印庚，吳立新，常亞青

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連 116023；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071)

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養(yǎng)殖大菱鲆腸炎病的流行病學(xué)和病原學(xué)研究

姜 燕1， 崔曉翠1， 張 正2*， 景亞運(yùn)1， 王印庚2，吳立新1，常亞青1

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連 116023；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071)

[目的]腸炎病是目前大菱鲆養(yǎng)殖行業(yè)中比較常見的疾病之一，該病感染率高，傳播迅速。[方法]從山東半島3個不同的養(yǎng)殖廠腸炎病發(fā)病大菱鲆體內(nèi)分離致病菌，對其進(jìn)行了常規(guī)生理生化特征測試和16SrRNA基因序列對比研究。[結(jié)果]從發(fā)病大麥鲆體內(nèi)共分離到了株優(yōu)勢細(xì)菌。理化特征分析結(jié)果顯示這3株菌中有2株分別與溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表型特征非常相似，另1株細(xì)菌被證實(shí)為非弧菌屬的細(xì)菌，具體定種尚需進(jìn)一步研究。分析這2株弧菌屬細(xì)菌的16SrRNA基因序列并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明這些菌株與溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的親緣關(guān)系最近。[結(jié)論]從發(fā)病大菱鲆體內(nèi)分離菌株的2株細(xì)菌被鑒定為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。

大菱鲆；腸炎??；16SrRNA；溶藻弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(Scophthalmus maximusL)隸屬鲆科菱鲆屬，分布于歐洲沿岸各主要海區(qū)，是歐洲水產(chǎn)品市場廣受歡迎的一種名貴魚種，具有較高經(jīng)濟(jì)價值。我國國內(nèi)的大菱鲆商業(yè)養(yǎng)殖始于1997年。近幾年由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疾病的暴發(fā)也越來越頻繁。每年我國的養(yǎng)殖大菱鲆因疾病的損失就達(dá)4億～5億元[1]。丁春林等[2]對養(yǎng)殖大菱鲆進(jìn)行了系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)腸炎病是養(yǎng)殖大菱鲆較為常見的疾病之一。筆者從山東半島不同的養(yǎng)殖廠采集發(fā)病大菱鲆的樣品，并進(jìn)行細(xì)菌分離和系統(tǒng)病原鑒定研究。

1　材料與方法

1.1病魚樣品的采集從山東半島3個不同的養(yǎng)殖廠采集到患腸炎病的大菱鲆樣品，分別來自萊州市、青島市流亭鎮(zhèn)和榮成市。這3個病魚樣品的腸壁都可見明顯充血，且呈紅色，腸道中淤積了大量的黃白色糞便和黏液。

1.2菌種的采集分離及培養(yǎng)基無菌挑取病魚腸道中的白色糞便和黏液接種于鹽度3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24～30h后，挑取優(yōu)勢菌的單個菌落純化2遍后，置于20%甘油中-80 ℃冰箱下保存。

1.3形態(tài)觀察和生理生化試驗使用NikionE800光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌個體形態(tài)、大小和鞭毛，用半固體培養(yǎng)基穿刺接種培養(yǎng)和水浸片結(jié)合觀察細(xì)菌運(yùn)動性。參照伯杰氏細(xì)菌手冊(第9版)對細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)分類[3]，使用API20E試劑條(法國生物梅里埃公司)結(jié)合菌種鑒定管(北京陸橋公司)進(jìn)行常見碳氮源利用和酶反應(yīng)的測定，對于一些特征性反應(yīng)則手工配制相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行。

1.416SrRNA序列測定與分析

1.4.1PCR模板的制備。將細(xì)菌接種在TSB平板上，28 ℃下培養(yǎng)24h。取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 ℃ 水浴5～10min后，4 ℃下12 000r/min離心10min，上清液即為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

1.4.216SrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增和序列測定。16SrRNA基因擴(kuò)增的正向引物P27f，5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’，反向引物P1429r，5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物為細(xì)菌16SrRNA基因序列擴(kuò)增的通用引物)。PCR反應(yīng)體系(100μL)：1×PCR緩沖液、1.5mmol/LMgCl2、4×dNTP混合物125μmol/mL、引物各7.5nmol/mL、TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)、1μLDNA原液。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30s，55 ℃復(fù)性30s，72 ℃延伸100s，35個循環(huán)；最后72 ℃溫育15min。最后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.4.3序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。將所獲得的3株菌的16SrRNA基因序列使用BIOEDIT軟件進(jìn)行對比分析，確定其相似性。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取與他們相似率最高的細(xì)菌16SrRNA基因序列，使用BIOEDIT軟件中集成的ClustalW軟件進(jìn)行多序列匹配排列，使用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包PHYLIP3.6a3進(jìn)行統(tǒng)計和聚類分析。采用鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行發(fā)育系統(tǒng)樹分析，通過自舉分析(Bootstraping)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹評估，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次[4]。

1.4.4通過系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建16SrRNA基因序列來源。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取25株與所分析的細(xì)菌16SrRNA基因序列相似性較高的已知種菌株，與分離到的菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所選取菌株的相關(guān)數(shù)據(jù)和基因編號見表1。

表1　構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的16S rRNA基因序列及其數(shù)據(jù)庫編號

2　結(jié)果與分析

2.1流行病學(xué)特征腸炎病患病魚病征主要表現(xiàn)為停止攝食或吃食后再吐出，腸道中沒有食物，但有大量的黏性柱狀白色物質(zhì)。病情嚴(yán)重者，腹部扁平、下陷，整個內(nèi)臟團(tuán)萎縮，肝臟大量出血，體色逐漸變淡(圖1)。該病在苗期和養(yǎng)成期均較常見，尤其多見于養(yǎng)成期，親魚期很少見到。此病的危害性較大，整池感染率可達(dá)90%以上，病魚表現(xiàn)為慢性死亡，日死亡率均為7%～8%。

圖1　大菱鲆腸炎病的外觀癥狀Fig. 1　External appearance of S. maximus with enteritis disease

2.2細(xì)菌的形態(tài)特征及運(yùn)動性從這3個病魚樣品中分別分離到1株優(yōu)勢細(xì)菌，將其分別編號為菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ。這3株菌在鹽度3%的TSB下培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24～30h后，其中菌株Ⅳ和菌株Ⅵ形成的單個菌落均很小、透明、接近無色，菌株Ⅴ形成的單個菌落較大、呈彌散性分布。3株細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果全部呈陰性，短桿狀。水浸片顯微檢查和半固體瓊脂穿刺接種培養(yǎng)都未發(fā)現(xiàn)這3株菌有明顯的運(yùn)動性。在TCBS瓊脂平板培養(yǎng)基上，菌株Ⅳ能生長但菌落不呈黃色，菌株Ⅴ和菌株Ⅵ都呈明顯黃色的菌落。

2.3細(xì)菌的生長特性這3株菌的溫度生長范圍存在一定的差異性，菌株Ⅳ在20～35 ℃范圍內(nèi)生長，20 ℃下微弱生長，高于35 ℃幾乎不生長。菌株V在10～40 ℃范圍內(nèi)都能生長，并且沒有太大的生長速度差異。菌株VI在20～30 ℃范圍內(nèi)生長，低于20 ℃時仍能微弱生長，10 ℃時完全不生長，高于30 ℃時幾乎不生長。在鹽度3%～5%的范圍內(nèi)這3株細(xì)菌生長非常良好；若此鹽度范圍，這3株細(xì)菌表現(xiàn)出一定的生長差異性。在pH高于7的范圍內(nèi)，這3株菌都能良好生長，證明這3株細(xì)菌都是嗜堿性的。

2.4生理生化特征 由表2可知，這3株細(xì)菌在一些陽性項目上的差異是比較明顯的。由于菌株Ⅳ在TCBS瓊脂平板培養(yǎng)基上的菌落不顯示黃色以及它對O/129抑制劑不敏感，因此初步斷定這株細(xì)菌不是弧菌屬細(xì)菌。菌株Ⅴ和菌株Ⅵ在TCBS平板上的菌落都呈明顯黃色的菌落，對O/129特征性抑制劑敏感，因此可將菌株Ⅴ和Ⅵ確定為弧菌屬細(xì)菌。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)菌株Ⅴ在一些指標(biāo)上與溶藻弧菌(Vibrio alginolytocus)非常相似，初步判斷菌株Ⅴ為溶藻弧菌。由于菌株Ⅵ還未查到與其生理生化特征相同或相似的菌株，暫時鑒定為弧菌屬細(xì)菌。

2.5 16SrRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將這3株細(xì)菌16SrRNA基因序列分別輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與菌株Ⅳ相似性最高的前100個序列中50%以上的序列是未鑒定的或非可人工培養(yǎng)的細(xì)菌。其中相似率最高的為一種UnculturableMariana eubacterium細(xì)菌的16SrRNA序列，相似率為99.79%。與菌株Ⅴ相似性最高的前100個序列中91%為弧菌屬細(xì)菌，與其最相近的1條16SrRNA序列是溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16SrRNA序列，相似率為99.58%。與菌株Ⅵ相似性最高的前100個序列中87%為弧菌屬細(xì)菌，與其相似率最高的是大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)的16SrRNA序列，相似率為99.64%。

從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取與菌株Ⅴ和菌株Ⅵ的16SrRNA序列相似性較高的29株細(xì)菌的16SrRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，B5(菌株Ⅴ)與V.alginolyticus自然聚類成一個分支，B6(菌株Ⅵ)與V.scophthalmi自然聚類成一個分支。B4(菌株Ⅳ)則單獨(dú)形成一個分支。

綜合生理生化特征的試驗結(jié)果和16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析的結(jié)果，可初步判斷從患白便病的大菱鲆腸道中分離的3株優(yōu)勢細(xì)菌中2株分別為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。另1株優(yōu)勢菌由于沒有相似率較高的已知種菌株可供比對，暫時還是一種未知細(xì)菌。

表2　分離菌株的主要生化特征

注：(+)表示弱陽性生長。

Note: +indicatedweakpositivegrowth.

圖2　16S rRNA基因序列的聚類分析結(jié)果Fig. 2　Results of 16S ribosomal RNA cluster analysis

3　結(jié)論與討論

腸炎病是養(yǎng)成期大菱鲆的常見疾病，流行范圍較廣，在黃渤海沿岸的大菱鲆養(yǎng)殖區(qū)發(fā)生較為普遍。腸炎病雖然是內(nèi)臟器官的病變，但具有典型的外觀發(fā)病特征，在生產(chǎn)過程中比較容易發(fā)現(xiàn)和識別。針對來源不同的樣品，筆者對腸炎病進(jìn)行病原分離，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜。筆者從腸道白便中分離到大菱鲆弧菌、溶藻弧菌和1株目前還無法定種的非弧菌屬細(xì)菌。從病原學(xué)的研究結(jié)果來看，與白便病發(fā)病相關(guān)的細(xì)菌可能不止1種。

溶藻弧菌是我國近海海水養(yǎng)殖業(yè)的常見病原菌之一，可造成多種魚、蝦、貝類的死亡[5-8]。目前在我國關(guān)于該菌對養(yǎng)殖大菱鲆的病害研究還屬于空白，盡管已經(jīng)從發(fā)病的大菱鲆體內(nèi)檢測到溶藻弧菌，并已證實(shí)在大菱鲆腸炎病發(fā)病狀態(tài)下溶藻弧菌是優(yōu)勢菌群之一，但對于該種弧菌確切的入侵方式、準(zhǔn)確的致病力以及是原發(fā)病原還是繼發(fā)病原還需要更深入的研究。大菱鲆弧菌是弧菌屬中命名種名時間不長的一種細(xì)菌。據(jù)報道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期腸道中占優(yōu)勢數(shù)量的一種細(xì)菌，正常情況下并無致病性[9-10]。大菱鲆弧菌在來自不同地理區(qū)域的大菱鲆樣品腸道中都能被檢測出來，在一些育苗場的水體中和活餌體內(nèi)也曾被檢測出來，但在一些池底沉積物中并不常見[11]。在其他的海水養(yǎng)殖魚類中還沒有分離到大菱鲆弧菌的報道，國內(nèi)的文獻(xiàn)也沒有關(guān)于大菱鲆弧菌致病性的研究報道。據(jù)此推斷，大菱鲆弧菌可能是大菱鲆引進(jìn)養(yǎng)殖過程中帶入我國的一個新菌種，它是健康大菱鲆腸道中的正常優(yōu)勢菌群，但在大菱鲆患有一些消化道疾病和其他病原菌的入侵下是可能轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【模瑢儆诶^發(fā)性病原。然而，關(guān)于該菌一些病原學(xué)方面的具體特性還需要深入的研究。此外，在大菱鲆的腸道疾病中還分離到1株未知的非弧菌屬細(xì)菌，通過對其生理生化特征和16SrRNA基因序列的研究，并未在已有文獻(xiàn)資料中找到相似性很高的已鑒定菌種，對這株細(xì)菌和相關(guān)病原學(xué)方面將開展更為深入的研究。

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EpizooticandAetiologicalStudyontheEnteritisDiseaseinCulturedScophthalmus maximus

JIANGYan1,CUIXiao-cui1,ZHANGZheng2*etal

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian,Shandong116023; 2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,Qingdao,Shandong266071)

[Objective]ToresearchtheepidemiologyandetiologyoftheenteritisdiseaseinculturedScophthalmus maximus. [Method]PathogenicbacteriawereisolatedfromS. maximuswithenteritisdiseaseindifferentaquaticplantsofShandongpeninsula.Thetraditionalphysiologicalandbiochemicaltestsand16SrRNAsequencinganalysiswerecarriedout. [Result]ThreestrainswereisolatedfromthediseasedS. maximus.ResultsofphysicochemicalcharacteristicsshowedthattwostrainswerethesameasVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi,whiletheotherstrainwasidentifiedtobebacteriumnotbelongingtoVibrio,andfurtherresearchwasstillneeded.The16SrRNAsequenceofthetwostrainswasanalyzedandmolecularphylogeneticdendrogramwereconstructed.ResultshowedthattherewashighlevelofconsanguinitybetweenVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi. [Conclusion]ThetwostrainsisolatedfromS. maximusareidentifiedtobeVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi.

Scophthalmus maximus;Enteritisdiseases; 16SrRNA; Vibrio alginolyticus; Vibrio scophthalmi

姜燕(1990- )，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物病害防控。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動物病原學(xué)研究。

2016-05-10

S941

A

0517-6611(2016)17-123-04