溫斐婷，成向榮，陳侃俊，王 菲，樂國偉，施用暉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

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槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定及其對HepG2細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

溫斐婷，成向榮，陳侃俊，王 菲，樂國偉*，施用暉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

[目的]探究AAPH誘導(dǎo)的槲皮素氧化產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響。[方法]用紫外-可見波長掃描、HPLC-MS方法分析AAPH和槲皮素在37 ℃下反應(yīng)12 h生成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；以槲皮素-AAPH反應(yīng)產(chǎn)物處理HepG2細(xì)胞24 h，測定其對細(xì)胞存活率、ROS水平及細(xì)胞總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、GSH/GSSG比值及丙二醛(MDA)含量的影響，并測定Nrf2、Keap1、NQO1、Prdx1相關(guān)抗氧化基因的mRNA表達(dá)。[結(jié)果] AAPH與槲皮素體系在反應(yīng)12 h后于294 nm波長處有特征吸收，LC-MS解析結(jié)果表明該體系反應(yīng)生成了含4種主要氧化產(chǎn)物的混合物。與空白組相比，槲皮素與AAPH氧化產(chǎn)物孵育顯著降低了細(xì)胞存活率，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量升高，細(xì)胞內(nèi)T-AOC水平、GSH-Px及SOD活性顯著降低，并顯著下調(diào)Nrf2、NQO1、Prdx1 mRNA表達(dá)，上調(diào)Keap1 mRNA表達(dá)。[結(jié)論]槲皮素氧化產(chǎn)物可造成HepG2細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。

槲皮素；氧化產(chǎn)；HepG2細(xì)胞；氧化應(yīng)激

以槲皮素為代表的黃酮類物質(zhì)是重要的植物化合物，其膳食攝入對人體心腦血管保護(hù)具有特殊意義[1]。但隨著研究的深入，已有不少體外評價(jià)實(shí)驗(yàn)和動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些黃酮類化合物在高濃度、長時(shí)間作用時(shí)表現(xiàn)出生物毒性，且其毒性與促氧化作用密不可分[2-3]。黃酮類化合物的還原形式主要起抗氧化作用，但其氧化形式半苯醌、苯醌和甲基醌有很強(qiáng)的促氧化作用，會導(dǎo)致谷胱甘肽(GSH)減少，與尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]和其他細(xì)胞還原劑的協(xié)同氧化，并伴隨活性氧(ROS)的產(chǎn)生[4-5]。

有研究指出，槲皮素清除自由基的中間產(chǎn)物具有生物毒性，可能是導(dǎo)致高濃度槲皮素促氧化現(xiàn)象出現(xiàn)的原因之一。在清除自由基的過程中，槲皮素吸收1或2個(gè)·H形成半苯醌和苯醌，而半苯醌和苯醌的活性形式可直接誘導(dǎo)DNA氧化損傷[6]。此外，高濃度槲皮素(>0.2 mmol/L)會促進(jìn)O2-·和H2O2的產(chǎn)生，導(dǎo)致活性酶SH-基團(tuán)的氧化[7]。但目前直接針對槲皮素清除自由基過程中生成的氧化產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞毒性研究的報(bào)道較少。2，2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)是常用的ROS誘導(dǎo)劑，能夠在機(jī)體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地促進(jìn)ROS 生成[8]。筆者以AAPH作為氧化劑，模擬了槲皮素的自由基清除過程，并初步鑒定了兩者在化學(xué)體系中的反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，探究了該產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響，旨在為探討高濃度槲皮素促氧化傾向的潛在機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑。人肝癌細(xì)胞株HepG2，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；槲皮素，美國Sigma公司；AAPH，上海阿拉丁生物科技公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；小牛血清，浙江省杭州四季青生物材料工程研究所；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針，美國Sigma公司產(chǎn)品；CAT、SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Trizol試劑盒，上海生工生物工程公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2儀器。UV2300雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜(HPLC)儀、質(zhì)譜(MS)儀，美國Waters公司；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；7900 HT Fast Real-Time PCR儀，美國ABI公司；5804R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物制備及紫外掃描。取槲皮素100 μmol/L與AAPH 600 μmol/L于37 ℃水浴反應(yīng)，分別于0、3、6、9、12 h取樣，進(jìn)行紫外-可見光全波長掃描(200～600 nm)，確定槲皮素氧化產(chǎn)物的特征吸收波長。

按Q∶AAPH=1∶6的濃度比，取槲皮素5 mmol/L與AAPH 30 mmol/L于37 ℃水浴，分別于0、6、9、12 h取樣進(jìn)行高效液相色譜測定。

1.2.2高效液相色譜條件及質(zhì)譜條件。高效液相色譜儀，Waters Acquity UPLC；檢測器：Waters Acquity PDA；色譜柱：BEH-C18(250.0 mm×4.6 mm)；流動相A：甲醇；流動相B：0.1%甲酸；流動相的等度洗脫條件為：45%B+55%A(20 min)；檢測波長為200～600 nm；分析波長為294 nm；進(jìn)樣量為10 μL；流速0.3 mL/min；柱溫保持在37 ℃。

質(zhì)譜離子方式為負(fù)離子；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：100 ℃；溶劑溫度：250 ℃；脫溶劑氣體流速：500 L/h。錐孔氣體流速：50 L/h，碰撞能量：30 eV，質(zhì)量范圍：50～1 500 m/z；檢測器電壓：1 700 V。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化，按1×106個(gè)/板傳入培養(yǎng)皿。

1.2.4試驗(yàn)分組及處理。槲皮素5 mmol/L與AAPH 30 mmol/L于37 ℃水浴反應(yīng)9 h，制備槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物。細(xì)胞貼壁后分別采用不同條件處理，試驗(yàn)分組如下：正常對照組(CON)，槲皮素氧化產(chǎn)物處理組0.1 μmol/L(QO0.1)、1.0 μmol/L(QO1)、10.0 μmol/L(QO10)、50.0 μmol/L(QO50)、100.0 μmol/L(QO100)、200.0 μmol/L(QO200)、300.0 μmol/L(QO300)。

1.2.5MTT法測定細(xì)胞存活率。HepG2細(xì)胞以8 000個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁24 h后，換無血清培養(yǎng)基，分別加入0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0、300.0 μmol/L槲皮素氧化產(chǎn)物，繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后，加入0.5 mg/mL MTT，孵育4 h。以150 μL DMSO溶解沉淀，在525 nm波長下測定吸光度。

存活率=試驗(yàn)組OD值/正常對照組OD值×100%

1.2.6DCFH-DA法測定活性氧自由基(ROS)。細(xì)胞分別加入0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L槲皮素氧化產(chǎn)物，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入100 μL終濃度為10.0 μmol/L的DCFH-DA 探針，避光孵育30 min，M5熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

ROS水平=(試驗(yàn)組熒光值/試驗(yàn)組細(xì)胞存活率)/(正常對照組熒光值/正常對照組細(xì)胞存活率)

1.2.7抗氧化酶活性測定。HepG2細(xì)胞以1.7×105個(gè)/孔濃度接種于6孔板中，分組及處理同“1.2.6”，孵育結(jié)束后加RPMI細(xì)胞裂解液150 μL于冰上裂解細(xì)胞，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液。采用BCA法測定蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi)T-AOC、GSH-Px、SOD及MDA含量均按照試劑盒說明書測定。

1.2.8qRT-PCR檢測基因mRNA表達(dá)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。qRT-PCR測定相關(guān)基因的mRNA水平。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃終末延伸2 min，循環(huán)40次。基因引物序列見表1。

表1　基因的引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定槲皮素100.0 μmol/L與600.0 μmol/L AAPH于37 ℃水浴反應(yīng)，溶液經(jīng)過紫外-可見分光光度計(jì)全波長掃描后所得圖譜如圖1所示，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，槲皮素在254和374 nm處的特征吸收峰吸光值持續(xù)下降，而294 nm處的吸收持續(xù)上升，在12 h后可看到明顯的吸收峰，表明新生成的槲皮素氧化產(chǎn)物紫外特征吸收波長為294 nm。

圖1　槲皮素氧化產(chǎn)物紫外-可見全波長掃描圖譜Fig.1　UV-vis spectra of quercetin oxidation

由圖2、3可見，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，在2.07、2.67、3.97、6.57 min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)峰面積都增加，表明這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)是槲皮素氧化產(chǎn)物的特征出峰時(shí)間。選取高效液相色譜圖譜中4個(gè)特征峰進(jìn)行物質(zhì)分析，結(jié)果如圖4所示，2.07和3.97 min的物質(zhì)為槲皮素被氧化后，在A環(huán)發(fā)生裂解后B環(huán)和C環(huán)分別加氫生成的產(chǎn)物，分子量分別為154和170。2.67 min的物質(zhì)為槲皮素A環(huán)的雙鍵被氧化，分別加合上甲氧基和氧的產(chǎn)物，分子量為350。6.57 min的物質(zhì)為槲皮素B環(huán)上的2個(gè)羥基脫掉2個(gè)氫生成的鄰醌，分子量為300。

圖2　槲皮素-AAPH反應(yīng)不同時(shí)間產(chǎn)物的高效液相圖譜Fig.2　HPLC chromatogram on each reaction time of quercetin oxidation products

注：*表示兩組間存在顯著差異。Note：*stands for significant difference between two groups.圖3　槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物液相圖不同保留時(shí)間的峰面積變化Fig.3　Changes of peak areas on each retention time in HPLC chromatogram of quercetin oxidation products

2.2槲皮素氧化產(chǎn)物對細(xì)胞存活率及ROS水平的影響正常生理狀況下，細(xì)胞內(nèi)ROS生成和清除處于動態(tài)平衡，但是一旦抗氧化功能降低或者ROS過多都能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激使細(xì)胞受到損傷。用不同濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物分別對HepG2細(xì)胞進(jìn)行孵育，孵育6 h后，與對照組相比，低濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物組細(xì)胞存活率未發(fā)生顯著變化，但氧化產(chǎn)物200.0和300.0 μmol/L濃度下細(xì)胞存活率顯著下降，且時(shí)間越長，下降越顯著；孵育24 h后，300.0 μmol/L濃度組細(xì)胞存活率降至70.34%。隨著孵育時(shí)間的增加，較低濃度的氧化產(chǎn)物也使細(xì)胞存活率顯著降低；孵育48 h后，0.1 μmol/L濃度下存活率下降顯著，半數(shù)致死劑量為300.0 μmol/L。0.1、1.0 μmol/L的低濃度槲皮素氧化產(chǎn)物孵育12 h，細(xì)胞ROS水平與空白組相比無顯著差異，但隨著槲皮素氧化產(chǎn)物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞ROS水平極顯著增加(圖5)。說明高濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物能使細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)較大死亡，而低濃度在長時(shí)間孵育下也能夠造成細(xì)胞一定程度的死亡。

圖4　槲皮素氧化產(chǎn)物特征峰的 MS 分析Fig.4　MS spectrum of fractions at different retention time from HPLC

圖5　槲皮素氧化產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞存活率及ROS水平的影響Fig.5　The influence of quercetin oxidation products to HepG2 cell viability and the ROS

2.3槲皮素氧化產(chǎn)物對細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響SOD、GSH-Px是細(xì)胞受到外界刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性的抗氧化酶類，清除胞內(nèi)活性氧物質(zhì)，對維持氧化與抗氧化平衡起著重要作用，其活性可間接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[9-10]。T-AOC能全面衡量機(jī)體防御體系氧化還原狀態(tài)。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)被活性氧氧化后的產(chǎn)物，是評價(jià)細(xì)胞氧化損傷程度的重要標(biāo)志物，其升高可直接反映受到的氧化應(yīng)激損傷。

由圖6可知，槲皮素氧化產(chǎn)物孵育細(xì)胞12 h后，0.1、1.0、10.0 μmol/L低、中濃度組中細(xì)胞T-AOC水平與SOD活力相較CK組無顯著變化，100.0 μmol/L濃度組有輕微下降。但隨孵育時(shí)間延長，T-AOC水平出現(xiàn)顯著下降，連續(xù)孵育48 h后，低濃度組細(xì)胞內(nèi)SOD活力也顯著下降。與CK組相比，50.0、100.0 μmol/L高濃度組中細(xì)胞T-AOC水平在12 h孵育后即出現(xiàn)顯著下降。

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。Note：* stands for P<0.05；** stands for P<0.01; *** stands for P<0.001.圖6　槲皮素氧化產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響Fig.6　The effect of quercetin oxidation products on antioxidant index of HepG2 cell

0.1、1.0、10.0 μmol/L低、中濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物孵育12 h，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力較CK組顯著增加；但隨孵育時(shí)間延長，酶活力下降，24 h時(shí)10.0 μmol/L組的GSH-Px活力已低于CK組水平；當(dāng)孵育48 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性出現(xiàn)急劇下降。和低濃度組不同，100.0 μmol/L高濃度組中細(xì)胞GSH-Px活力則是在12 h孵育后即出現(xiàn)顯著下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于低濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物在短時(shí)間孵育的條件下并未對細(xì)胞造成較大影響，細(xì)胞內(nèi)少量的ROS導(dǎo)致GSH-Px活性出現(xiàn)應(yīng)激性的上調(diào)。但在孵育48 h后，ROS產(chǎn)生量超過了細(xì)胞的清除能力，GSH-Px活性受到抑制，10.0 μmol/L濃度組酶活出現(xiàn)急劇下降。

細(xì)胞內(nèi)MDA含量則隨著加入的槲皮素氧化產(chǎn)物濃度的升高而升高，并與孵育時(shí)間成正比，提示槲皮素氧化產(chǎn)物濃度的升高和孵育時(shí)間的增長均造成了細(xì)胞內(nèi)脂肪氧化加劇，進(jìn)一步說明細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制已經(jīng)不能清除ROS，細(xì)胞內(nèi)形成了氧化應(yīng)激。

2.4槲皮素及其氧化產(chǎn)物對細(xì)胞氧化還原相關(guān)mRNA表達(dá)的影響ROS能夠損傷細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)并破壞其生理功能，為了緩解細(xì)胞所遭受的損傷，細(xì)胞內(nèi)存在一整套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子核細(xì)胞系因子2相關(guān)因子(Nrf2)是細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵基因，與Keap1作用，轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生一些抗氧化物，如SOD、血紅素氧合酶(HO-1)、NADPH苯醌氧化還原酶1(NQO-1)等II相解毒酶，以及過氧化還原酶(Prdx)、金屬硫蛋白(MT-1)等抗氧化酶，從而對抗ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激，保護(hù)正常細(xì)胞不受破壞[11-13]。該研究對 Nrf2 以及其部分下游靶基因mRNA表達(dá)。

由圖7可知，在與槲皮素氧化產(chǎn)物共同孵育24 h后，1.0與10.0 μmol/L低濃度組細(xì)胞中Nrf2基因表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，而50.0與100.0 μmol/L高濃度組細(xì)胞中Nrf2出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明在長時(shí)間作用下，低濃度槲皮素氧化產(chǎn)物造成細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，Nrf2代償性表達(dá)上調(diào)，但高濃度槲皮素氧化產(chǎn)物則直接抑制了Nrf2的表達(dá)。而細(xì)胞中Keap1基因表達(dá)均由于槲皮素氧化產(chǎn)物的加入而顯著上調(diào)，并隨著其濃度的升高上調(diào)越顯著。

NADPH苯醌氧化還原酶1(NQO-1)[11]可借助NADP催化體內(nèi)醌類化合物發(fā)生還原反應(yīng)。由圖7可知，低濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物可以顯著上調(diào)NQO-1的表達(dá)，而50.0 μmol/L的氧化產(chǎn)物對NQO-1的影響與CK組無顯著差異，100.0 μmol/L組則顯著下調(diào)NQO-1的表達(dá)。過氧化物還原酶(Prdx)在細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)中起著重要作用。過氧化物還原酶是通過硫氧還蛋白系統(tǒng)清除細(xì)胞內(nèi)新陳代謝所產(chǎn)生的過氧化物[14]。圖7顯示，槲皮素氧化產(chǎn)物低濃度組均造成了細(xì)胞內(nèi)Prdx表達(dá)的顯著升高，提示該試驗(yàn)條件下造成了細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。而高濃度的槲皮素氧化產(chǎn)物則對細(xì)胞內(nèi)Prdx基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。

3　結(jié)論

通過紫外-可見分光光譜和LC-MS法初步鑒定了槲皮素-AAPH氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并測定了槲皮素氧化產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞存活率和自由基水平的影響，以及氧化還原狀態(tài)、抗氧化通路相關(guān)基因的測定。結(jié)果表明，槲皮素氧化產(chǎn)物會加劇細(xì)胞的氧化應(yīng)激，具有一定的細(xì)胞毒性，高濃度的槲皮素有可能是通過其在清除自由基過程中形成的大量氧化產(chǎn)物而造成促氧化現(xiàn)象的出現(xiàn)。

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。Note：* stands for P<0.05；** stands for P<0.01; *** stands for P<0.001.圖7　槲皮素氧化產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞Nrf2、Keap-1、NQO-1及Prdx表達(dá)的影響Fig.7　The influence of quercetin oxidation products to Nrf2，Keap-1，NQO-1 and Prdx expression of HepG2 cell

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Structure Identification of the Quercetin Oxidation Products Induced by AAPH and Effects on the Redox State of HepG2 Cells

WEN Fei-ting, CHENG Xiang-rong, CHEN Kan-jun, LE Guo-wei*et al

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The aim was to explore how the quercetin oxidation products induced by AAPH influence the redox state of HepG2 cells. [Method] Quercetin was mixed with APPH as oxidant under 37 ℃ for 12 h. The structural characterization were analyzed by UV scan and LC-MS. HepG2 cells were treated with reaction product of quercetin-AAPH and incubated for 24 h. Viable cells were harvested, and the cell viability, ROS level, glutathione (GSH) and glutathione disulphide (GSSG) content, malandialdehyde (MDA) level, total antioxidant capacity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity were assayed with the appropriate test kits, the oxidant stress related genes were assayed by DNA microarray. [Result] The chromatogram showed peaks eluting at 294 nm after 12 h reaction and the structural analysis result indicated that mixture of four oxidation products were obtained in the reaction system. Compared with the blank group, Quercetin-AAPH oxidation products elevated the ROS and MDA generation, and reduced cell viability, T-AOC, CAT, GSH-Px and SOD and GSH/GSSG activity significantly. Nrf2, NQO-1, Prdx expression level was down-regulated and Keap-1, Nox-2, Cox-2 expression level was up-regulated in the meanwhile. [Conclusion] These findings indicate that quercetin oxidation products could prompt HepG2 cells to generate more oxidative stress.

Quercetin; Oxidation products; HepG2 cells; Oxidative stress

溫斐婷(1990- )，女，廣西玉林人，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與功能因子。*通訊作者，教授，博士，從事營養(yǎng)與功能因子研究。

2016-04-26

Q 2

A

0517-6611(2016)17-034-05