黃莉娜，王劍峰，高 成，劉廣純

(沈陽大學，遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，遼寧沈陽 110044)

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不同齡期果蠅DNA含量的檢測與比較

黃莉娜，王劍峰，高 成，劉廣純*

(沈陽大學，遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，遼寧沈陽 110044)

[目的]測定8種果蠅不同齡期的DNA含量。[方法]從黑果蠅(Drosophilavirilis)和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的7個突變品系的幼蟲Ⅰ齡、Ⅱ齡、Ⅲ齡、蛹、成蟲提取總DNA。使用紫外可見分光光度計對提取的DNA含量進行測定，并對提取的DNA進行了PCR效果檢測。[結(jié)果]8種果蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ齡幼蟲DNA含量遞增，大部分蛹和成蟲DNA含量遞減；果蠅5個齡期提取DNA的PCR效果均很好，成蟲最佳，幼蟲次之。[結(jié)論]幼蟲、蛹和成蟲的DNA質(zhì)量均可保證PCR擴增、分子克隆、物種鑒定等實驗的開展。

果蠅；齡期；DNA含量；PCR

脫氧核糖核酸(DNA)是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，它們的載體是染色體或染色質(zhì)。為了維持世代間的平衡，大多數(shù)生物的體細胞中所含的染色體和形態(tài)都是恒定的。因此，細胞中所含DNA的量也是基本恒定的，DNA含量可作為一個物種種質(zhì)的特征性參數(shù)[1]。DNA含量的測定作為限制性與非限制性酶切反應、PCR擴增、分子克隆、物種鑒定等分子研究的起點，可以判斷生物體生理病理的變化，同時對基因表達、致病基因檢測和藥效評價具有重要的價值[2]。

在昆蟲學研究領(lǐng)域，基于DNA可以開展DNA條形碼研究，用于解決法醫(yī)昆蟲鑒定、外來入侵害蟲快速識別等難題[3]。法醫(yī)昆蟲的鑒定，通過尸體上繁殖的蛆蟲可以用于判斷是否移尸并估計死亡時間[4]。入境檢驗檢疫部門截獲的昆蟲大多數(shù)為卵和幼蟲。幼蟲的特征形態(tài)差異小，在不同的發(fā)育時期有些特征不夠穩(wěn)定，因此依靠形態(tài)學進行物種鑒定不夠準確[5]。Elderkin等[6]利用DNA條形碼成功鑒定了Hexagenialimbata和Hexageniarigida2種蜉蝣幼蟲。岳巧云等[5]通過COⅠ基因?qū)π螒B(tài)無法區(qū)分的鞘翅目幼蟲進行了鑒定，證實了DNA條形碼在幼蟲鑒定方面的實用性和準確性。但是，不同齡期幼蟲、蛹及成蟲的DNA含量不盡相同，在進行DNA鑒定時效果并不一致，是否可以有效提取DNA以及提取的DNA的含量和質(zhì)量將會直接影響PCR效果，進而對物種的鑒定產(chǎn)生影響。

果蠅具有生活周期短、容易飼養(yǎng)、繁殖力強、染色體數(shù)目少且易于觀察等特點，因而是遺傳學研究的最佳材料[7]。作為經(jīng)典的模式生物，果蠅被廣泛應用到各種研究中。筆者選用8個品系果蠅作為試驗材料，通過對8個品系果蠅的5個齡期的DNA含量進行檢測與分析，分析不同品系果蠅DNA含量的差異以及同一品系果蠅5個齡期DNA含量的變化，同時進行PCR效果檢測。

1　材料與方法

1.1試驗材料選取黑果蠅[Drosophilavirilis(D)]和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的7個突變品系的5個齡期(Ⅰ齡、Ⅱ齡、Ⅲ齡、蛹、成蟲)作為試驗材料，7個突變品系具體見表1。均由遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室長期飼養(yǎng)。

1.2DNA提取總DNA的提取采用破碎的方法，1個樣品中包含5頭果蠅。將浸泡于無水乙醇中的果蠅取出，用1×TE(Tris，EDTA)緩沖液洗滌2次，使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒按照說明書進行總DNA的提取，溶于100 μL buffer TE，并于-20 ℃下保存。

1.3DNA含量的測定使用UV-3200PCS紫外分光光度計進行DNA含量的測定。

1.4PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳 使用Agilent Sure Cycle 8800梯度PCR儀對提取DNA進行PCR擴增，采用通用引物[8]：LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACC-AAAAA-ATC-3’)。PCF反應體系(30 μL)：ddH2O 21.25 μL、10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.4 μL、上下游引物各0.6 μL、Taq酶5 U/μL(0.15 μL)、DNA模版2 μL。PCR擴增反應條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，41個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR擴增產(chǎn)物與6×loading buffer混合均勻，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果。使用DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DYCP-31A瓊脂糖電泳槽進行電泳，電泳完成后使用BIO-RAD凝膠電泳成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。

表1　黑腹果蠅的7個品系

2　結(jié)果與分析

2.1各品系果蠅5個齡期DNA含量的比較由表2可知，8種果蠅DNA含量為0.61～7.08 μg/頭，8種果蠅幼蟲的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ齡的DNA含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，蛹和成蟲的DNA含量則呈下降趨勢。 其中，黑果蠅DNA含量為0.92～3.98 μg/頭，蛹期最少(0.92 μg/頭)，Ⅲ齡幼蟲的DNA含量最高(3.98 μg/頭)。野生型黑腹果蠅的DNA含量為0.08～1.10 μg/頭，其中成蟲的DNA含量最高，為1.10 μg/頭。短剛毛型的DNA含量為1.46～4.02 μg/頭，其中Ⅰ齡期與成蟲相同，Ⅲ齡期最高(4.02 μg/頭)。匙狀翅型黑腹果蠅的DNA含量為0.80～2.72 μg/頭，其中Ⅲ齡期最高(2.72 μg/頭)。白眼型果腹果蠅的DNA含量為0.79～1.33 μg/頭，其中含量最高的是Ⅲ齡期為1.33 μg/頭。新三隱型黑腹果蠅的DNA含量為0.61～1.50 μg/頭，其中蛹的含量最高(1.50 μg/頭)。白眼黃身型黑腹果蠅的DNA含量為0.89～1.83 μg/頭，其中Ⅲ齡DNA含量最高(1.83 μg/頭)，成蟲的DNA含量最低(0.89 μg/頭)。殘翅型黑腹果蠅的DNA含量為1.00～7.08 μg/頭，其中蛹的DNA含量最高(7.08 μg/頭)，成蟲的含量最低(1.00 μg/頭)。

表2　8種果蠅5個齡期DNA含量的比較

2.28種果蠅5個齡期DNA含量的比較由表2可知，幼蟲Ⅰ齡時DNA含量從小到大依次為黑腹果蠅的新三隱型、白眼型、野生型、匙狀翅型、白眼黃身型、短剛毛型、殘翅型、黑果蠅。幼蟲Ⅱ齡時DNA含量從小到大依次黑腹果蠅的野生型、白眼型、新三隱型、白眼黃身型、匙狀翅型、短剛毛型、殘翅型、黑果蠅。Ⅲ齡幼蟲的DNA含量從小到大依次為黑腹果蠅野生型、新三隱型、白眼型、白眼黃身型、匙狀翅型，黑果蠅，黑腹果蠅短剛毛型、殘翅型。蛹的DNA含量從小到大依次為黑腹果蠅匙狀翅型、野生型、黑果蠅、黑腹果蠅白眼型、新三隱型、白眼黃身型、短剛毛型、殘翅型。成蟲DNA含量從小到大依次為黑腹果蠅白眼黃身型、殘翅型、新三隱型、匙狀翅型、野生型、白眼型、短剛毛型、黑果蠅。

2.38種果蠅提取DNA的PCR效果檢測從圖1可以看出，黑果蠅和黑腹果蠅的7個突變型品系的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ齡幼蟲、蛹

注：a.Ⅰ齡幼蟲；b.Ⅱ齡幼蟲；c.Ⅲ齡幼蟲；d.蛹期；e.成蟲。Note：a.Ⅰ instar larva；b.Ⅱ instar larva；c.Ⅲ instar larva；d.Pupa；e.Imago.圖1　不同齡期8種果蠅提取DNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of the PCR product of DNA extracted from 8 species of fruit flies at different ages

和成蟲都獲得了清晰的條帶，PCR擴增效果均較好，其中成蟲的PCR擴增效果最好。DL2000中500 bp條帶最亮，每次用量約為34 ng，其他條帶的DNA用量均為17 ng。5頭樣品共有100 μL，平均每頭樣品為20 μL，樣品每次上樣2 μL。8種果蠅每頭Ⅰ齡幼蟲的COI含量均大于340 ng，Ⅱ齡幼蟲中黑果蠅、黑腹果蠅短剛毛型、白眼型、白眼黃身型和殘翅型的COI含量均大于340 ng，新三隱型和匙狀翅型的COI含量均為170～340 ng，野生型COI含量則低于170 ng，Ⅲ齡幼蟲黑腹果蠅殘翅型的COI含量低于170 ng，其余7種的COI含量均高于340 ng，蛹期和成蟲的COI含量均大于340 ng。

3　結(jié)論

該試驗結(jié)果表明8種果蠅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ齡幼蟲DNA含量遞增，幼蟲的Ⅲ齡個體最大，大部分蛹和成蟲DNA含量遞減。成蟲的DNA含量并不是果蠅DNA含量的最高時期。黑果蠅的DNA 含量明顯高于其他品系。除黑果蠅以外，Ⅲ齡幼蟲的DNA含量往往是5個齡期最高的，DNA含量最低的時期最多出現(xiàn)在Ⅰ齡幼蟲或成蟲。果蠅5個齡期DNA的PCR擴增效果都很好，其中成蟲的PCR擴增效果最好，幼蟲次之。幼蟲、蛹和成蟲都可作為分子鑒定的材料，為物種鑒定提供幫助。

[1] 范兆廷，尹洪濱，宋蘇祥.十三種淡水養(yǎng)殖魚類的DNA含量[J].水產(chǎn)學報，1995，19(4)：322-326.

[2] 戴二黑.病毒核酸定量測定方法及其存在問題[J].國外醫(yī)學(病毒學分冊)，2002，9(1)：12-24.

[3] 岳巧云，馮文軍，王章根，等.DNA條形碼技術(shù)在鑒定蛆癥異蚤蠅中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(6)：1400-1402.

[4] 王浜琴，蔡繼峰，葛燕，等.尸源性昆蟲的法醫(yī)學研究進展[J].法醫(yī)學雜志，2008，24(3)：210-213.

[5] 岳巧云，邱德義，黃義文，等.DNA條形碼技術(shù)在未知昆蟲幼蟲種類鑒定中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21(3)：615-617.

[6] ELDERKIN C L，CORKUM L D，BUSTOS C.DNA barcoding to confirm morphological traits and determine relative abundance of burrowing mayfly species in western Lake Erie[J].Journal of great lakes research，2012，38(1)：180-186.

[7] 李廷利，許光輝，徐瑞鑫.影響野生型Canton S 果蠅睡眠神時間的相關(guān)生理因素[J].中國實驗動物學報，2010，18(2)：105-108.

[8] FOLMER O，BLACK M，HOEH W，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molcular Mar Biol Biotechnol，1994，3(5)：294-299.

Detection and Comparison of DNA Content in Fruit Flies in Different Periods

HUANG Li-na, WANG Jian-feng, GAO Cheng, LIU Guang-chun*

(Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Ecological Security, Shenyang University, Shenyang, Liaoning 110044)

[Objective] The aim was to determine DNA content in 8 fruit flies at different ages. [Method] Total DNA was extracted from Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ instar larva, pupa, imago of 7 mutant lines ofDrosophilavirilisandDrosophilamelanogaster. DNA content was determined by ultraviolet visible spectrophotometer, PCR detection was conducted on DNA. [Result] The contents of DNA in eight fruit flies I, II and III instar larva were increased, and the contents of DNA in most of the pupa and imago were decreased; the efficiency of PCR of fruit flies in five periods were all good, imago was the best, larva was better. [Conclusion] The DNA quality of larva, pupa and imago all can ensure the experiments carry out such as the PCR amplification, molecular cloning, species identification and so on.

Fruit flies; Age; DNA content; PCR

國家自然科學基金項目(31201743，31372245)；遼寧省教育廳科學研究項目(12013452)。

黃莉娜(1991- )，女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，研究方向：昆蟲系統(tǒng)學和分子生物學。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事昆蟲系統(tǒng)分類和害蟲防治研究。

2016-04-23

S 186

A

0517-6611(2016)17-007-02