容維中，張艷麗(執(zhí)筆)，王　珂

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心)

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早勝牛及其雜交類群IGF-II基因分子遺傳特性分析

容維中1，張艷麗2(執(zhí)筆)，王珂1

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心)

采用PCR-SSCP檢測和DNA測序技術(shù)，分析了早勝牛及其雜交類群IGF-II基因第2外顯子的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明，第2外顯子檢測到1處SNPs(T116C)，產(chǎn)生了 2 種等位基因(E、F)和 3 種基因型(EE、EF、FF)，其中，E為優(yōu)勢等位基因，EF型為優(yōu)勢等位基因型；群體多態(tài)信息含量為0.42，處于中度多態(tài)，表明該位點遺傳變異程度較高，人工選擇潛力較大，這為后期開展IGF-II基因多態(tài)性與其肉用性狀的相關(guān)性分析提供了一定的理論基礎(chǔ)。

早勝牛；IGF-II基因；PCR-SSCP；肉用性狀；選育

隴東地區(qū)位于甘肅省東部，屬于典型的黃土高原溝壑山區(qū)，境內(nèi)氣候適宜，農(nóng)作物秸稈資源豐富，自古就有養(yǎng)牛的傳統(tǒng)和習(xí)慣。通過多年人工馴化和雜交選育而成的優(yōu)良地方類群—早勝牛，于1986年被列入《甘肅省畜禽品種志》，被廣泛應(yīng)用于全省黃牛雜交改良實踐中，帶動了當(dāng)?shù)厝馀．a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但長期以來在選育方向和產(chǎn)業(yè)定位等方面，與其它各地一樣都存在盲目引種開展雜交改良，而忽視對地方黃牛脂肪沉積好、肉質(zhì)細(xì)嫩等特性的挖掘和利用。

應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)在保留地方良種特性的基礎(chǔ)上，選育肉牛新品種已成為現(xiàn)代育種手段之一。IGF-II基因(促胰島素生長因子2)屬于胰島素生長因子家族， 與胰島素具有高度的同源性， 對胚胎發(fā)育、骨骼生長、脂肪沉積等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。基于此，本研究采用PCR-SSCP檢測和DNA測序技術(shù)，對IGF-II基因序列特征及遺傳特性進(jìn)行了分析，旨在為確定可用于肉用性狀選育的優(yōu)勢基因型和開展早勝牛肉用新品種早期選育提供分子水平上的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物的選擇與血樣的采集在慶陽市寧縣興旺牧業(yè)有限責(zé)任公司選擇30頭體質(zhì)健康、年齡相近的早勝牛及其雜交類群(南德溫×早勝牛雜交一代、安格斯×早勝牛雜交一代)，采用靜脈采血法，每頭牛采集血樣7 mL。

1.1.2引物設(shè)計與合成參照已發(fā)表在Genebank上的IGF-II基因核苷酸序列(登錄號：DQ298739)，采用Prime 5.0 軟件設(shè)計引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。引物信息：上游5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′，下游5′-CTGTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′，擴(kuò)增區(qū)域為IGF-II基因第2外顯子，擴(kuò)增長度為217 bp。

1.2方法

1.2.1PCR擴(kuò)增對檢測合格的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：總體積50 μL，其中2×Taq Master Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/uL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件為:：94℃預(yù)變性5 min，34個循環(huán)(94℃變性5 min，63℃退火30sec，72℃延伸30 sec)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2SSCP檢測與測序取2 μL PCR產(chǎn)物與6 μl變性緩沖液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025%二甲苯青)混勻，98℃變性10 min后置于冰水浴上5 min，然后上樣于非變性聚丙烯酰胺凝膠(濃度為12%、交聯(lián)度為29∶1)，在4℃、220 v的條件下預(yù)電泳20 min，然后將電泳槽接通電源后放在冰箱中(4℃、140 v)恒溫恒壓電泳12～18 h。電泳結(jié)束后，用優(yōu)化后的銀染法(染色和顯色兩步)進(jìn)行染色和判型，將不同基因型個體送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測序。

1.2.3數(shù)據(jù)處理利用PopGen 32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、純合度(Ho)和雜合度(He)，利用PIC CALC V0.6軟件計算多態(tài)性信息含量(PIC)。

2　結(jié)果

2.1基因組DNA提取

由圖1可見，采用D3471型血液DNA提取試劑盒提取的DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，經(jīng)分光光度計檢測，OD260/OD280值為1.7，純度較好，可用于PCR反應(yīng)。

圖1　血液基因組 DNA 凝膠電泳圖

2.2PCR-SSCP

從圖2可以看出，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無非特異性片段，且片段長度與目的條帶大小一致。經(jīng)PCR-SSCP檢測和測序，IGF-II基因Exon2位點在116 bp處發(fā)生了T/C的單堿基突變，產(chǎn)生了EE、FF和EF 3種基因型，如圖3和圖4所示。

圖2　PCR 擴(kuò)增結(jié)果　　　　　　　　　圖3　PCR-SSCP檢測結(jié)果

圖4　不同基因型測序結(jié)果

2.3遺傳指標(biāo)分析

表1顯示，IGF-II基因Exon2位點，早勝牛及其雜交類群中E為優(yōu)勢等位基因，EF型為優(yōu)勢等位基因型。該群體純合度為0.69，多態(tài)信息含量為0.42，屬于中度多態(tài)，表明Exon2位點，早勝牛及其雜交類群遺傳變異較大。

表1　IGF-II基因Exon2位點遺傳指標(biāo)分析

3　分析與討論

IGFs家族是一類具有多種生理功能的因子，含IGF-I和IGF-II 兩種類型，對多數(shù)組織和細(xì)胞的生長、分化、繁殖起維持和調(diào)節(jié)的作用，是影響畜禽經(jīng)濟(jì)性狀表達(dá)的主效基因之一。關(guān)于IGF-I基因多態(tài)性的研究主要集中在生長發(fā)育性狀方面，暮松智報道，涼山半細(xì)毛羊IGF-1基因不同基因型對初生重、斷奶重和斷奶日增重有顯著影響(P<0.05)。潘和平等研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因內(nèi)含子1多態(tài)性對大通牦牛6月齡、12月齡、18月齡體重及體斜長有顯著影響(P<0.05)。近幾年，關(guān)于IGF-II基因的研究較為活躍，對豬、牛、羊、鵝等畜禽IGF-II基因多態(tài)性與其生長發(fā)育、胴體性狀的關(guān)聯(lián)性方面已有相關(guān)報道，許多研究結(jié)果表明IGF-II基因可能是影響畜禽胴體性狀及肉質(zhì)的重要候選基因。

早勝牛作為甘肅省優(yōu)良地方類群，通過多年選育提高，具有生產(chǎn)以脂肪沉積為特點的優(yōu)質(zhì)牛肉的潛質(zhì)和培育肉牛新品種的可能，研究影響早勝牛肉用性狀的主效基因?qū)ζ溥z傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。本研究采用PCR-SSCP檢測和DNA測序技術(shù)，分析了早勝牛及其雜交類群IGF-II基因外顯子2的序列特征及遺傳特性，檢測發(fā)現(xiàn)在第2外顯子116 bp處發(fā)生了T→C的單堿基突變，由此產(chǎn)生了E、F 2個等位基因和EE、EF、FF 3種基因型，這與韓瑞華、張爭鋒分別在秦川牛和南陽牛上的檢測結(jié)果類似，另據(jù)報道，IGF-II基因在第4外顯子、第7內(nèi)含子及第8內(nèi)含子上也存在多態(tài)性，還有待于進(jìn)一步驗證，但上述研究報道都表明IGF-II基因具有豐富的多態(tài)性。多態(tài)信息含量與群體雜合度一般作為反映群體遺傳多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值的大小表明群體遺傳變異水平的高低。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-II基因第2外顯子，群體雜合度為0.31，多態(tài)信息含量為0.42，屬于中度多態(tài)，表明該位點早勝牛及其雜交類群遺傳變異程度較高，人工選擇潛力較大，適合作為分子候選標(biāo)記位點。

本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了IGF-II基因第2外顯子的分子遺傳特性，揭示了該位點多態(tài)性豐富，這為后期開展IGF-II基因多態(tài)性與早勝牛肉用性狀的相關(guān)性分析，篩選確定可用于肉用性狀選育的優(yōu)勢基因型，加快肉用新品種選育提供了理論基礎(chǔ)。

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Analysis of the Molecular Genetic Characteristics of IGF-II Gene in Zaosheng Cattle and its Hybrid Groups

RONG Wei-zhong1, ZHANG Yan-li2, WANG Ke1

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstitute,PingliangGansu744000China;2.ExamineandInspectionCenterforAgriculturalProductsSafetyandQualityinPingliangCity)

PCR-SSCP examine and DNA sequencing technologies were conducted to detect single nucleotide polymorphism of IGF-II gene with exon 2 in Zaosheng cattle and its hybrid groups. The results showed that there were one SNPs (T116C), two alleles and three genotypes (EE、EF、FF), and allele E and Genotype EF were respectively identified as the dominant allele and genotypes. Zaosheng cattle and hybrid groups achieved moderate polymorphisms with PIC of 0.42, and IGF-II gene with exon 2 displayed a higher genetic variability and larger artificial selection potential. Therefore, this study could provide certain theoretical basis with association analysis of genetic polymorphism in IGF-II gene and beef performance traits.

Zaosheng cattle; IGF-II gene; PCR-SSCP; beef performance traits; breeding

1004-6704(2016)04-0024-03

2016-04-15

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃(1207TCYL016)。

容維中(1965-)，男，甘肅平?jīng)鋈?，本科，副研究員，研究方向為動物營養(yǎng)及牛羊繁殖技術(shù)。

S 813.3

A