徐　陽，王　軍，武海闊

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

桃核承氣湯對糖尿病大鼠大血管纖維病變Toll樣受體通路作用研究*

徐陽，王軍，武海闊

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］通過免疫印記法檢測實驗性Ⅱ型糖尿病大鼠下肢股血管中Toll樣受體-2（TLR-2）、Toll樣受體-4 （TLR-4）表達，并通過觀察桃核承氣湯對相關指標影響，揭示糖尿病大血管纖維化病變的發(fā)病機制，及中藥桃核承氣湯在糖尿病血管纖維化中的干預作用。［方法］雄性SD大鼠170只，隨機分為5組：A-正常對照組（n=30），余140只造糖尿病模型模，造模成功123只，隨機分為4組：B-模型對照組（n=31）、C-中藥高劑量治療組（n=30）、D-中藥中劑量治療組（n=31）、E-中藥低劑量治療組（n=31）；A組不予藥物干預，B組每日給予0.9%生理鹽水10 mL/kg灌胃，C組每日給予桃核承氣湯1.8g/kg，D組每日給予桃核承氣湯0.9g/kg，E組每日給予桃核承氣湯0.45g/kg。藥物干預第1周、12周、20周，按計劃處死大鼠，各組分別取材，保存標本，免疫印記法檢測TLR-2、TLR-4沉積部位及表達情況。［結果］TLR-2、TLR-4在糖尿病大鼠股動脈中均顯著表達，中藥桃核承氣湯干預可有效降低TLR-2及TLR-4的表達。［結論］糖尿病大血管病變可能與Toll樣受體通路有關，中藥組方桃核承氣湯對糖尿病大血管病變有明顯改善作用，可減緩纖維化進程，其干預作用于用藥劑量和用藥時間相關。

大血管纖維化；桃核承氣湯；Toll樣受體2；Toll樣受體-4

糖尿病的發(fā)病率在全球呈快速增長趨勢，其已經成為另一大嚴重影響人類生命質量的慢性疾病。研究發(fā)現糖尿病患者截肢標本中，血管病變是以內膜的纖維性增厚為主脂質沉積以纖維成分所占比例大［1］。本研究從Toll樣受體（TLRs）通路探討糖尿病血管纖維病變機制，并闡明活血化瘀藥物干預糖尿病血管纖維病變機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物清潔級雄性SD大鼠170只，2月齡，體質量160～200 g，由天津實驗動物中心提供。

1.1.2實驗藥物桃核承氣湯（桃仁∶大黃∶桂枝∶甘草∶芒硝=2∶2∶1∶1∶1），由天津中醫(yī)藥大學顆粒劑藥房制作，每克顆粒劑相當于生藥10 g，根據人與大鼠體表面積換算，人桃仁用藥劑量為30 g時，大鼠的用藥劑量約為每日0.90 g/kg。生理鹽水：天津大家制藥有限公司生產。精蛋白鋅胰島素注射液：400 IU/瓶，由江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司生產。

1.1.3實驗儀器血糖儀：德國羅氏活力型血糖儀。穩(wěn)壓電泳儀：六一儀器，北京。高速離心機：Sigma，美國。水浴箱：精宏實驗設備有限公司，上海。干燥消毒烤箱（DHG-9246A）：精宏試驗設備有限公司，上海。臺式離心機：Eppendorf公司，德國。轉膜儀：六一儀器，北京。灌胃針、注射器、10 mL玻璃瓶、止血鉗、直剪、試管、吸管等。

1.1.4實驗試劑Toll樣受體-2（TLR-2）一抗：Abcam，英國。Toll樣受體-4（TLR-4）一抗：Abcam，英國。Lysis buffer：Sigma，美國。Western Lightning? -ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate：Perkin Elmer，美國。牛血清白蛋白：Sigma，美國。GAPDH內參抗體：賽爾生物，天津。辣根過氧化酶（HRP）標記二抗：賽爾生物，天津。DAB顯色試劑盒：中衫金橋，北京。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組造模前分組：A-正常對照組（n= 30）、其余實驗組（n=140）；按計劃造模，造模意外死亡大鼠9只，另8只大鼠未成模，剔除實驗。造模后分組：A-正常對照組（n=30）、B-模型對照組（n= 31）、C-中藥高劑量治療組（n=30）、D-中藥中劑量治療組（n=31）、E-中藥低劑量治療組（n=31）；其中A組為正常血糖組；B、C、D、E組共123只大鼠非禁食狀態(tài)下血糖維持在25.0 mmol/L左右。

1.2.2實驗干預所有大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，A組繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組高脂高糖喂養(yǎng)，誘導胰島素抵抗，4周后，B、C、D、E 4組分別造糖尿病模型。B、C、D、E組共123只大鼠成功制成糖尿病模型后，穩(wěn)定血糖1周，維持非禁食狀態(tài)血糖25.0 mmol/L左右，開始進入實驗二階段。

A組不予藥物干預，B組給予0.9%生理鹽水10mL/（kg·d）灌胃，C組給予桃核承氣湯1.8g/（kg·d），D組給予桃核承氣湯0.9 g/（kg·d），E組給予桃核承氣湯0.45 g/（kg·d）。連續(xù)藥物干預第1周、12周、20周，按計劃處死大鼠，各組分別取材，保存標本，待動物實驗結束后進行下一步檢測分析。

1.3檢測分析

1.3.1取材方法嚴格按照上述方法飼養(yǎng)，分別于第1、12、20周，每組隨機選取10只大鼠（數量不足時按實際情況選?。?，禁食24 h后，用10%的水合氯醛3 g/kg麻醉，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定在大鼠固定板上，先用清水濕潤股內側及腹股溝區(qū)的鼠毛，然后再用剪子剪去鼠毛進行備皮，備皮后常規(guī)消毒手術區(qū)皮膚。根據股動脈搏動情況確定股動脈的位置和走行方向，沿股動脈走向縱向切開皮膚，用蚊式鉗鈍性分離組織，以暴露股動脈鞘。分離時動作要輕柔，不得用刀剪等銳利器械，以防損傷血管和神經。股動脈鞘內有并行的股動脈、股靜脈、股神經，直徑由粗到細，其中呈粉紅色且觸之有搏動的粗大血管即為股動脈。用眼科鑷順著血管走向鈍性分離股動脈約4～5 cm，兩端剪斷，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，平均分成兩部分，一部分采用4%多聚甲醛進行固定，另一部分置于無菌凍存管中，-80℃冰箱保存。

1.3.2標本TLR-2、TLR-4免疫印記檢測蛋白印跡（Western blotting）法：1）將組織剪成小塊，并置于勻漿器中。勻漿器中加入適量的含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上作用并不斷的對組織樣本進行勻漿處理，收集裂解后的細胞碎片及釋放出的蛋白。然后利用BSA蛋白定量法對各樣本的蛋白濃度進行分析。2）SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠。取32 μL總蛋白+8 μL的5×Loading Buffer經煮沸3min后立即冰置3 min，上樣。100 V電壓電泳。3）電轉膜：電泳分離后的蛋白電轉至硝酸纖維素膜上（Millipore，USA），350 mA，120 min，在4℃進行。4）封閉：將硝酸纖維素膜做標記以區(qū)分正反面及左右側，浸入Blotto封閉液中，室溫搖床上輕輕搖動1.5 h。5）與一抗的結合：在搖床上4℃輕輕搖動過夜。6）在1× TBST中搖動浸洗3次×5 min，洗去非特異結合的一抗。7）與二抗的結合：將上膜和下膜分別浸入含相應HRP標記二抗的Blotto中，室溫輕輕搖動2 h。8）在1×TBST中搖動浸洗3次×5min，洗去非特異結合的二抗。9）最后用Western Lightning?-ECL，EnhancedChemiluminescenceSubstrate（PerkinElmer，NEL100001EA）檢測，顯影。

1.4統(tǒng)計學處理所有統(tǒng)計計算均用SAS v9.1.3統(tǒng)計分析軟件進行，計量資料以均數±標準差（±ss）表示，正態(tài)分布計量資料組間比較單因素方差分析，偏態(tài)分布計量資料組間比較Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結果

實驗過程順利，各組死亡大鼠共15只：A組1只，B組5只，C組2只，D組3只，E組4只，實驗結束時各組實驗大鼠數量為：A組9只，B組6只，C組8只，D組8只，E組7只。

2.1大鼠股動脈TLR-2 Western blotting檢測分析見表1。

表1　各組大鼠股動脈TLR-2比較（±ss）Tab.1　Comparison of TLR-2 from the femoral artery of rat in each group（±ss）

表1　各組大鼠股動脈TLR-2比較（±ss）Tab.1　Comparison of TLR-2 from the femoral artery of rat in each group（±ss）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，；與高劑量組比較，△P＜0.05，；與中劑量組比較，▲P＜0.05，。

組別動物數　第1周　動物數　第12周　動物數　第20周A組　10　0.137±0.054　10　0.053±0.017　9　0.083±0.045 B組　10　0.462±0.105*　10　0.819±0.160*　6　0.846±0.337* C組　10　0.337±0.116*#　10　0.213±0.039*#　8　0.327±0.081*#D組　10　0.380±0.096*△　10　0.364±0.091*#△　8　0.495±0.200*#E組　10　0.457±0.124*△　10　0.618±0.160*△▲　7　0.557±0.282*

實驗第1周：除模型組、中劑量組、低劑量組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。實驗第12周：除模型組與低劑量組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。實驗第20周：除模型組與低劑量組及各中藥組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

用藥1周后高劑量組即可表現出對TLR-2的干預作用，而用藥至12周，中劑量組與高劑量組均對TLR-2起到的干預作用，但高劑量組干預作用較中劑量組明顯。用藥至20周，高劑量組與中劑量組干預效果相近。

2.2各組大鼠股動脈TLR-4 Western blotting檢測分析見表2。實驗第1周：正常對照組與各組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），模型組與各組及各中藥組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。實驗第12周：除模型組與低劑量組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。實驗第20周：除中藥各組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。用藥1周后各中藥組未表現出對TLR-4的干預作用，而用藥至12周，中劑量組與高劑量組均對TLR-4起到的干預作用，但高劑量組干預作用較中劑量組明顯。用藥至20周，各中藥組對TLR-4干預效果相近。

表2　各組大鼠股動脈TLR-4比較（±ss）Tab.2　Comparison of TLR-4 from the femoralartery of rats in each group（±ss）

表2　各組大鼠股動脈TLR-4比較（±ss）Tab.2　Comparison of TLR-4 from the femoralartery of rats in each group（±ss）

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05；與高劑量組比較△P＜0.05；與中劑量組比較▲P＜0.05。

組別動物數　第1周　動物數　第12周　動物數　第20周A組　10　0.150±0..035　10　0.087±0.023　9　0.085±0.043 B組　10　0.569±0.145*　10　0.843±0.208*　6　1.208±0.256* C組　10　0.434±0.168*　10　0.294±0.113*#　8　0.307±0.121*#D組　10　0.487±0.185*　10　0.469±0.192*#△　8　0.383±0.125*#E組　10　0.504±0.185*　10　0.829±0.258*△▲　7　0.405±0.126*#

2.3各組大鼠TLR-2、TLR-4 Western blotting灰度值觀察及分析見圖1。TLR-2：模型組大鼠TLR-2表達高于普通對照組（P＜0.05）；中藥干預1周后，中藥高劑量組TLR-2表達有所降低（P＜0.05），中藥中劑量組與中藥低劑量組TLR-2表達未見明顯降低（P＞0.05）；中藥干預12周后，中藥高劑量組與中藥中劑量組TLR-2表達明顯降低（P＜0.05），以中藥高劑量組下降較為明顯（P＜0.05），中藥低劑量組TLR-2表達有所降低（P＜0.05）；中藥干預20周后，中藥高劑量組TLR-2表達降低（P＜0.05），中藥中劑量組和中藥低劑量組TLR-2表達未見明顯降低（P＞0.05）。TLR-4：模型組大鼠TLR-4表達明顯高于普通對照組（P＜0.05）。中藥干預1周后，各中藥干預組TLR-4表達無明顯降低（P＞0.05）；中藥干預12周后，中藥高、中劑量組TLR-4表達明顯降低（P＜0.05），中藥低劑量組TLR-4表達未見明顯降低（P＞0.05）；中藥干預20周后，中藥高、中、低劑量組TLR-4表達明顯降低（P＜0.05）。

圖1　各組大鼠TLR-2、TLR-4 Western blotting灰度值Fig.1　Gray value of TLR-2，TLR-4 of Western blotting of rats in each group

3　討論

前期研究發(fā)現糖尿病足患者血管病變是以內膜的纖維性增厚為主，脂質沉積以纖維成分所占比例大［2］。TGF-β1、CTGF、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ均在中、晚期糖尿病大鼠的大血管中顯著增加，提示糖尿病大血管病變可能與纖維化有關［3-4］。

TLRs是近年發(fā)現的先天性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體和病原模式識別受體之一。在TLRs與天然免疫應答關系研究中，倍受關注的是TLR-2和TLR-4［5］，其在介導腎［6］、心［7］、肝［8］、肺［9］、皮膚［10］等多種組織器官纖維化進程中起十分重要的作用，可能是最主要的致纖維化細胞因子［11-12］。TLRs在動脈纖維化過程中可能起著“分子開關”的重要作用［13-16］。

桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》，桃核承氣湯可以通過增強超氧化物歧化酶（SOD）的含量和抑制一氧化氮合酶（NOS）的基因表達，增強抗自由基的作用，起到保護血管內皮細胞的作用［17-18］，也可以加抑制肝纖維化大鼠TGFβ1的表達，達到抗肝纖維化作用［19］。桃核承氣湯對膠原的降解作用增強，使基質合成和降解向平衡方向發(fā)展［20］，進而達到降低血管纖維化的目的。預示通過活血化瘀藥物干預，有逆轉糖尿病大血管纖維化病變這一發(fā)展過程的可能性。

TLR-2、TLR-4在糖尿病大鼠股動脈中均顯著表達，提示糖尿病大鼠大血管的纖維病變可能與Toll樣受體通路開放及TLR-2、TLR-4高表達有關。中藥桃核承氣湯干預可有效降低TLR-2及TLR-4的表達，可明顯改善大血管病變情況，減緩纖維化進程，其干預作用于用藥劑量和用藥時間相關。在本實驗中發(fā)現，中藥桃核承氣湯干預12周時，各不同劑量組間TLR-2及TLR-4降低存在差異，以高劑量組降低最為明顯，但干預20周時各不同劑量組間TLR-2及TLR-4降低差異消失，表明中藥干預可能存在一定藥效蓄積作用，這也為我們的進一步研究提供了方向。

［1］Yu Y，Lyons TJ.Alethal tetrad in diabetes:hyperglycemia，dyslipidemia，oxidative stress，and endothelial dysfunction［J］.Am J Med Sci，2005，330（5）:227-232.

［2］李曉軍，郭建恩，龐宗然，等.糖尿病足患者截肢動脈組織的超微病理結構研究［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17（4）:411-412.

［3］王軍，徐陽，袁向科，等.實驗性糖尿病鼠大血管病變TGF-β 和CTGF的表達及中藥的干預作用［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29（3）: 266-269.

［4］丁志明，武海闊，王軍.膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ在糖尿病大鼠血管病變中的表達及中藥的干預［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29（6）.

［5］常曉彤，輦曉峰，王振輝.Toll樣受體信號轉導途徑研究進展［J］.生理科學進展，2011，42（5）:340-342.

［6］李在楠，嚴瑞，聶夢琪，等.Toll樣受體4在腎間質纖維化中的表達及意義［J］.貴州醫(yī)藥，2013，10（10）:867-873.

［7］康曉敏，呂宏娟，王霞，等.Toll樣受體4在血管緊張素Ⅱ致高血壓小鼠心臟纖維化中的作用［J］.中華老年心腦血管病雜志，2012，14（10）:1077-1081.

［8］彭莉，肖建華.TLR介導的信號通路在肝纖維化中的作用［J］.微生物學免疫學進展，2011，4（4）:84-87.

［9］周韶煒，邵伯棕，陳宣辰，等.shRNA特異性靜默大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因對染塵大鼠肺纖維化的抑制作用［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2013，26（02）：88-90.

［10］劉磊，方峰，葉波平.TLR3及其在皮膚纖維化疾病中作用的研究進展［J］.藥物生物技術，2013，1（1）:81-84.

［11］何征宇，朱也森.Toll樣受體4與人體纖維化疾病的關系［J］.上海交通大學學報（醫(yī)學版），2009，29（7）:873-877.

［12］武海闊，陳浩，王軍.Toll樣受體在大血管病變中作用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，1（01）:95-97.

［13］周立華，李軍，鄒娜姝，等.TLR2和TLR4相關疾病與藥物的研究進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2014，30（7）:767-770.

［14］Dunzendorfer S，Lee HK，Tobias PS.Flow-dependent regulation of endothelial Toll-like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity［J］.Circ Res，2004，95:684-691.

［15］Walton KA，Hsieh X，Gharavi N，et al.Receptors involved in the oxidized1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine-mediated synthesis of interleukin-8.Arole forToll-like receptor 4 and a glycosylphosphatidylinositol-an-chored protein［J］.J Biol Chem，2003，278（32）:661-666.

［16］Claudia Monaco，Scott M.Gregan，Tina J.Navin，et al.Toll-Like Receptor-2 Mediates Inflammation and Matrix Degradation in Human Atherosclerosis［J］.Circulation，2009，120:2462-2469.

［17］孫文斌，徐莉，何賽萍.桃核承氣湯對蓄血證大鼠血管MMP-2，TIMP-2基因表達的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2008，32（1）: 38-40.

［18］何賽萍，徐莉.桃核承氣湯對蓄血證大鼠血管內皮細胞保護作用的實驗研究［J］.中醫(yī)研究，2008，21（4）:11-14

［19］趙治友，鄔亞軍，張俊.加味桃核承氣湯對肝纖維化大鼠TGFβ1蛋白表達的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2010，34（2）:166-168.

［20］趙治友，鄔亞軍，林庚庭，等.加味桃核承氣湯對四氯化碳所致肝纖維化模型大鼠TIMP-1蛋白表達的影響［J］.中西醫(yī)結合肝病雜志，2007，17（1）:32-34.

（本文編輯：馬英，張震之）

Study of Taohe Chengqi Tang on Toll-like receptor passage in diabetic vascular fibrosis with rats

XU Yang，WANG Jun，WU Hai-kuo
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Using Western blotting to detect the expression of TLR-2，TLR-4 which from the diabetes rats in lower limb femoral vessels，and observing by Taohe Chengqi Tang（THCQT）impact on related indicators，revealing intervention mechanisms of THCQT on diabetic vascular fibrosis.［Methods］The 170 male SD rats were divided into five groups，A-the normal control group（n=30），other 140 making diabetes model and succeed 123，randomly divided into 4 groups：B-model control group（n=31），C-Chinese high-dose treatment group（n=30），D-medicine dose treatment group（n=31），E-low dose treatment group（n=31）.A group was no drug intervention，group B received 0.9%saline 10 mL/（kg·d）orally，group C was given THCQT 1.8 g/kg，D group was given THCQT 0.9 g/kg，E group was given THCQT 0.45 g/kg.Drug intervention first weeks，12 weeks，20 weeks，the rats were sacrificed according to plan，the groups were drawn，preserved specimens，Western blotting detection TLR-2 and TLR-4 expression.［Results］TLR-2 and TLR-4 has significant expression in diabetic rat femoral artery，TCD THCQT can effectively reduce the expression of TLR-2 and TLR-4.［Conclusion］Diabetic vascular disease may be associated with Toll-like receptor pathway and apoptosis，TCD THCQT can obviously improve diabetic vascular lesions，and slow down the fibrosis process，its intervention effect associated with dosage and duration.

macrovascular fibrosis；THCQT；Toll-like receptor-2；Toll-like receptor-4

R587.1

A

1672-1519（2016）05-0299-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.11

國家自然科學基金項目（81173268）。

徐陽（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)糖尿病足與周圍血管病相關研究工作。

2015-12-20）